半夏厚樸湯抗抑郁作用
——改善腦內氧化應激水平*

馬占強，李瑞鵬，李月碧，傅強，瞿融，馬世平**

1中國藥科大學中藥學院中藥藥理教研室，南京 211198；2南京中醫藥大學方劑教研室，南京 210046

半夏厚樸湯抗抑郁作用
——改善腦內氧化應激水平*

馬占強1，李瑞鵬1，李月碧1，傅強1，瞿融2，馬世平1**

1中國藥科大學中藥學院中藥藥理教研室，南京 211198；2南京中醫藥大學方劑教研室，南京 210046

目的：通過觀察半夏厚樸湯對慢性應激抑郁模型大鼠行為學和氧化應激的影響，研究半夏厚樸湯抗抑郁的機制。方法：采用強迫游泳實驗、開野實驗、糖水偏好實驗，研究半夏厚樸湯對慢性應激抑郁模型大鼠的抗抑郁作用，并通過UPLC-T-QMS系統檢測其大鼠腦內單胺類神經遞質的含量，部分動物取其海馬制備海馬勻漿，Western blotting檢測超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）。結果：與空白組相比，模型組大鼠糖水消耗量顯著下降，強迫游泳不動時間顯著延長，交叉次數、直立次數顯著減少；海馬內去甲腎上腺素、5-羥色胺含量顯著降低。與模型組相比，半夏厚樸湯組糖水消耗量顯著升高，強迫游泳不動時間顯著縮短。半夏厚樸湯組顯著增加大鼠腦內去甲腎上腺素和5-羥色胺含量。Western blotting檢測結果顯示，與模型組比較，半夏厚樸湯組顯著升高SOD水平，顯著降低MDA水平。結論：半夏厚樸湯能明顯改善慢性應激所致的大鼠抑郁行為，其機制可能與上調海馬內去甲腎上腺素、5-羥色胺水平，增強機體抗氧化應激能力有關。

半夏厚樸湯；抗抑郁；神經遞質；氧化應激

抑郁癥（depression）是一種以心境障礙為主要特征的綜合征，呈慢性、反復性發作，通常表現為：情緒低落、思維遲緩、運動抑制、食欲和睡眠障礙、悲觀厭世以及言語動作減少，嚴重者甚至會出現自殺等極端自殘的念頭。其發病率正在快速攀升，預計到2020年時抑郁癥可能成為僅次于缺血性心臟病的第二大疾病，其對患者及其家屬造成的痛苦、對社會造成的損失是其他疾病所無法比擬的[1-2]。半夏厚樸湯出自《金匱要略》，其方藥組成為：半夏、厚樸、茯苓、生姜、蘇葉。該方為治療情志不暢、痰氣互結所致的梅核氣（慢性咽炎）之常用方。本實驗室前期運用多種動物行為學模型證明半夏厚樸湯具有抗抑郁作用[3-4]。為進一步探究其作用機理，本實驗采用慢性不可預知應激方法建立大鼠抑郁模型，觀察半夏厚樸湯對應激大鼠行為學、氧化應激的影響。

1 材料

1.1 儀器

電子天平（北京賽多利斯天平有限公司，十萬分之一）；開野實驗箱（直徑30 cm，高20 cm）；UPLC Acquity TM系統（Waters公司）；Synapt TM TQ質譜儀（Waters公司），配有Lock-spray接口，電噴霧離子源（ESI）；Masslynx 4.1質譜工作站軟件（Waters公司）；紫外凝膠成像系統、瓊脂糖水平電泳儀（BIO-RAD公司，美國）。

1.2 藥物與試劑

半夏厚樸湯方中藥材半夏、厚樸、茯苓、生姜、蘇葉等購自南京益豐大藥房，并經中國藥科大學中藥資源學教研室秦民堅教授鑒定，藥材均符合《中國藥典》規定。將半夏厚樸湯各藥材按《金匱要略》原方比例配伍，裝入大圓底燒瓶中浸泡2 h，加8倍水加熱煮沸30 min，取出藥汁，再加入8倍水加熱煮沸30 min，過濾藥渣；取兩次藥汁合并蒸干后保存備用，計算浸膏得率為14.7%，使用時配制成所需濃度。鹽酸氟西汀（常州四藥制藥有限公司，規格：10 mg，批號：201107181）；抗體SOD（CST，2770S）；MDA（CST，5321S）；lumiGLO試劑（Cell Signaling，Beverly，MA）；其他試劑為國產分析純。

1.3 動物

清潔級SD大鼠，雄性，體重180～220 g，浙江省實驗動物中心，合格證號：SCXK（浙）2008-0033，飼養環境：中國藥科大學中藥藥理實驗室，動物分籠飼養，保持晝夜節律，室溫，自由飲水攝食。

2 方法

2.1 造模與給藥

參照文獻方法[5]。取雄性SD大鼠60只，按體重隨機分組為6組，分別為：空白組、模型組、氟西汀對照組、半夏厚樸湯低、中、高（濃度）6組。每組10只，置于單獨的鼠籠里，除常規空白組外其余5組給予連續3周的慢性不可預知性刺激：每天選取3～4個應激因子，避免重復，持續21 d。選用的應激因子包括：禁食（12 h）、禁水（12 h）、傾斜飼養（45°，12 h）、濕籠（灑100 mL水在墊料上）、持續光照（24 h）、噪音刺激（5 min）、搖晃鼠籠（5 min）、夾尾（距尾根1cm處夾閉1 min）。慢性刺激后，進行給藥，每日給藥一次，連續給藥3周，各組均按1 mL/100 g的劑量灌胃，空白組和模型組給純凈水，氟西汀對照組給0.01 g·kg-1，半夏厚樸湯低、中、高組分別給3、6、12 g·kg-1，給藥期間繼續造模。

2.2 行為學觀察

2.2.1 糖水消耗實驗給藥結束的第3天，分別測定各組大鼠的糖水消耗量（sucrose intake）。開始測量前禁水、禁食24 h，然后給予1%（w/v）的蔗糖水溶液，蔗糖水溶液分別置于2個相同的飲水瓶中，24 h后進行糖水消耗量的測定。測量時大鼠單獨飼養，每籠1只，2個飲水瓶中分別裝有普通飲用水和1%蔗糖水溶液，24 h后稱量大鼠在普通飲用水、1%蔗糖水以及總液體的消耗量。比較正常大鼠、慢性應激大鼠和給予半夏厚樸湯和鹽酸氟西汀的大鼠在糖水消耗及糖水偏愛方面的差異。糖水偏愛（sucrose preference，SP）以蔗糖水溶液的消耗量（g）/總液體的消耗量（g）×100%表示。

2.2.2 強迫游泳實驗各組大鼠在給藥結束的第4天進行強迫游泳實驗。參照Porsolt等[6]方法，將大鼠置于水深30 cm、水溫25°C的玻璃圓筒中，觀察6 min，比較各組大鼠在后4 min內的累計不動時間。不動時間判定：大鼠漂浮在水面，不努力爬出圓筒，僅做一些必須保持其頭部在水面的動作。

2.2.3 開野實驗于給藥結束的第2天用開野實驗裝置測定各組大鼠行為學的改變。參照Archer J等方法[7]，實驗裝置為直徑150 cm、高50 cm的圓筒，在安靜的環境下進行此項實驗觀察，觀察指標：以動物穿越底面格子（行走路線與格子交叉點數）為水平活動的次數，直立（兩前肢離地1 cm以上或攀附墻壁的次數）為垂直活動次數，并測定洗臉次數。將大鼠置于中心格子內適應2 min后，記錄4 min內大鼠自發活動。

2.3 大腦海馬組織神經遞質含量測定

測定樣本處理：大鼠直接斷頭，在冰臺上迅速取出腦組織，立即投入液氮中，精確稱重，每1 g腦組織加4 mL冰冷的甲醇液，于冰浴下快速玻璃棒攪拌勻漿。精密吸取1 mL勻漿液，4℃條件下14000 r·min-1離心20 min，取上清液真空冷凍干燥，殘留物用700 μL水溶解，渦漩振蕩10 s，加入氯仿-異丙醇（100∶30）混合液300 μL，渦漩振蕩2 min，離心（3000 r·min-1）5 min，取上層水相10 μL進樣（LC）[8]。

2.4 Western blotting檢測大鼠海馬內超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）

制備大鼠海馬蛋白樣品，用于SOD和MDA Western blot分析。采用Bradford法測定大鼠海馬樣品蛋白濃度（建成生物技術有限公司，中國南京），牛血清蛋白作為標準品。蛋白（上樣量為75 μg）經10%SDS-PAGE電泳分離后，將蛋白轉移到PVDF膜上（孔徑為0.45 μm，Pall，USA），然后在5%脫脂奶粉中封閉2 h，在不同的一抗中4℃孵育過夜。PVDF膜經0.5%TBS-T溶液洗膜3次，每次5 min。再與HRP標記的二抗進行反應，再用0.5% TBS-T溶液洗膜3次，每次5 min。最終膜用lumiGLO試劑孵育，然后用X光片顯出條帶，采用分析軟件（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）進行灰度值分析，計算目的蛋白與β-actin的灰度比值。所用一抗包括兔多克隆抗SOD（稀釋比例為1∶1000）、MDA（1∶1000）。

2.5 統計學處理

3 結果

3.1 強迫游泳實驗

結果見表1。與空白組相比，模型組大鼠的強迫游泳不動時間顯著增加；與模型組相比，半夏厚樸湯中、高劑量和氟西汀均能顯著縮短大鼠強迫游泳不動時間。

表1 半夏厚樸湯對慢性應激抑郁大鼠糖水偏好率、強迫游泳不動時間、開野實驗結果的影響（±s，n=6）

表1 半夏厚樸湯對慢性應激抑郁大鼠糖水偏好率、強迫游泳不動時間、開野實驗結果的影響（±s，n=6）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

開野實驗組別劑量（g·kg-1）糖水偏好率（%）強迫游泳不動時間（s）穿格次數直立次數空白82.6±10.3132.9±27.481.5±27.111.5±2.8模型55.7±12.1##194.7±30.3##33.9±17.8##4.1±2.0##鹽酸氟西汀0.0175.8±11.9**140.0±32.7**67.4±22.3**8.8±2.6**366.3±13.6178.3±31.453.9±28.35.9±2.1半夏厚樸湯671.3±14.2*165.9±28.4*57.5±21.4*7.5±2.7*1274.3±15.3*147.6±26.9**61.5±27.2*7.9±1.9**

3.2 糖水偏好實驗

結果見表1。與空白組大鼠比較，模型組大鼠糖水偏好率明顯降低；與模型組相比，半夏厚樸湯中、高劑量與鹽酸氟西汀顯著升高大鼠糖水偏好率。

3.3 開野實驗

結果見表1。與空白組大鼠比較，模型組大鼠自發活動能力明顯降低，表現為穿格次數、直立次數明顯減少；給予半夏厚樸湯后，與模型組相比，半夏厚樸湯中、高劑量組大鼠的穿格次數、直立次數顯著增加。

3.4 大鼠海馬組織神經遞質含量

與空白組相比，模型組5-HT和NE含量均顯著減少。與模型組相比，鹽酸氟西汀組與半夏厚樸湯低、中、高劑量組5-HT、NE含量均顯著增加。見表2。

表2 半夏厚樸湯對慢性應激抑郁大鼠海馬組織神經遞質含量的影響（±s，n=10）

表2 半夏厚樸湯對慢性應激抑郁大鼠海馬組織神經遞質含量的影響（±s，n=10）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別劑量（g·kg-1）5-HT（ng·mL-1）NE（ng·mL-1）空白-167.8±10.6196.3±9.2**模型-109.8±8.3##135.4±10.4##鹽酸氟西汀0.01157.4±11.9**177.4±8.2**3129.5±9.9*152.0±8.3**半夏厚樸湯6138.1±7.0**160.7±12.4**12149.2±7.2**170.5±8.8**

3.5 大鼠海馬內超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量

與空白組相比，模型組SOD表達顯著減少，MDA表達顯著增加；與模型組相比，鹽酸氟西汀組SOD表達顯著增加，MDA表達顯著減少，半夏厚樸湯低、中、高劑量組SOD表達顯著增加，MDA表達顯著減少。見圖1。

4 討論

圖1 大鼠海馬內超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的表達

抑郁癥發病機制復雜，慢性不可預見性應激經典模型常用于抑郁癥的病理生理機制和抗抑郁藥物作用機制的研究[9]。糖水偏好測定、強迫游泳實驗、開野實驗均模擬了抑郁癥患者的快感缺乏、興趣缺失、精神運動遲滯等抑郁表現。而半夏厚樸湯在糖水偏好實驗中能明顯增加大鼠的糖水偏好率；在開野實驗中能增加大鼠的自主活動與探究能力；在強迫游泳實驗中能減少強迫游泳大鼠的不動時間。諸此，證明了半夏厚樸湯的抗抑郁作用。

在抑郁癥的發病機制研究中，腦內單胺類神經遞質假說占有重要地位，尤其與去甲腎上腺素、5-HT和多巴胺等這類大腦原有的，用來協助神經元間信息傳導的物質有關[10]。本研究通過UPLC-TQMS系統，對慢性應激抑郁模型大鼠的海馬區單胺類遞質含量進行檢測，結果顯示，半夏厚樸湯能提高大鼠腦內去甲腎上腺素、5-HT遞質含量。半夏厚樸湯的抗抑郁作用機制與提高大鼠腦內神經遞質含量相關。

已有研究報道，抑郁癥的發生與氧化應激損傷關系密切[11-12]。抑郁癥是慢性的心理及生理應激過程，可引起體內神經內分泌系統的功能變化，并伴有氧化應激系統的激活，引起中樞神經系統的氧化損傷。臨床研究發現，重度抑郁癥患者體內SOD的活性降低，而MDA的含量升高[13]，給予清除自由基的藥物，能改善大鼠的抑郁癥狀。本實驗結果顯示，慢性抑郁模型大鼠大腦海馬MDA含量顯著升高，而SOD活性顯著降低，提示大鼠腦內氧化應激系統失衡，并出現脂質過氧化損傷；半夏厚樸湯低、中、高劑量組可顯著改善慢性抑郁模型大鼠抑郁癥狀，提高機體的抗氧化應激能力，減輕脂質過氧化損傷。

綜上所述，本實驗結果表明，半夏厚樸湯的抗抑郁作用機制除普遍認為可調節抑郁動物腦內單胺類水平之外，還可能與清除腦部自由基、提高腦部抗氧化酶的活性有關。

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Antidepressant-like Effects of Banxia Houpu Decoction by Improving the State of Oxidative Stress in the Brain*

MA Zhan-qiang1,LI Rui-peng1,LI Yue-bi1,FU Qiang1,QU Rong2,MA Shi-ping1**
1Department of Pharmacology for Chinese Materia Medica,School of Traditional Chinese Pharmacy,China Pharmaceutical University,Nanjing 211198,China;2Discipline of Chinese and Western Integrative Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210046,China

Objective：To study the anti-depression mechanism of Banxia Houpu Decoction.Methods：Rat models were established by chronic unpredictable mild stress(CUMS),sucrose consumption,open-field and forced swimming tests were used to observe the behavior of the model rats.UPLC-T-QMS was used to analyze the levels of monoamine neurotransmitters.Western blotting detected the levels of superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)in brain.Results：Compared with the normal group,the frequency of crossing and standing and the consumption of sucrose water in the depressive disorder rats decreased significantly,the duration of immobility in forced swimming test increased significantly,the contents of 5-HT and NA reduced.Compared with the model group,the frequency of crossing and standing and the consumption of sucrose water in the Banxia Houpu Decoction group rats increased significantly,the duration of immobility in forced swimming test decreased significantly.Western blotting analysis showed that, compared with the model group,Banxia Houpu Decoction could significantly elevate the levels of SOD,and significantly reduce the levels of MDA in hippocampus.Conclusion：Banxia Houpu Decoction improved the depression syndromes of rats induced by CUMS,of which the mechanism involved the upregulation of 5-HT and NE levels and enhancement of anti-oxidative stress ability.

Banxia Houpu Decoction;Anti-depression;Neurotransmitter;Oxidative stress

R965.1

A

1673-7806（2014）03-205-04

江蘇省自然科學基金面上項目資助（BK2011630）；中央高校基本科研業務費專項資金資助（JKQ2011036）；江蘇高校優勢學科建設工程項目（PAPD）；江蘇省普通高校研究生科研創新計劃（CXZZ13_03）

馬占強，男，博士生 E-mail:mazhanqiang0427@163.com

**通訊作者 馬世平，男，教授，博士生導師 E-mail:spma@cpu.edu.cn

2014-03-20

2014-03-31