鹽酸利多卡因眼用凝膠在兔眼房水中藥物濃度測定及藥動學研究

劉冰，徐曉文，林宏達，孫成龍，丁黎*，尤淋君

中國藥科大學 1藥物分析教研室；2新藥安全評價研究中心，南京 210009

鹽酸利多卡因眼用凝膠在兔眼房水中藥物濃度測定及藥動學研究

劉冰1，徐曉文1，林宏達1，孫成龍1，丁黎1*，尤淋君2

中國藥科大學1藥物分析教研室；2新藥安全評價研究中心，南京 210009

目的：建立兔眼房水中利多卡因的LC-MS/MS檢測方法，研究鹽酸利多卡因眼用凝膠在兔眼房水中的藥動學特征。方法：72只雄性新西蘭兔分成Ⅰ和Ⅱ兩組，每組36只，Ⅰ和Ⅱ組分別給予鹽酸利多卡因眼用凝膠受試制劑和參比制劑，左右眼均滴入15 μL，于不同時間點取房水樣品，經沉淀蛋白后，采用LC-MS/MS法測定房水中的利多卡因。以來曲唑為內標，采用Hanbon Hedera ODS-2 C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）色譜柱，流動相為甲醇-20 mmol·L-1醋酸銨水溶液（含0.1%甲酸）（55∶45，v/v），質譜采用氣動輔助電噴霧離子化和正離子多重反應監測。結果：利多卡因房水濃度在2.070～10350 ng·mL-1范圍內線性關系良好（r=0.9995）。單次給予新西蘭兔受試制劑和參比制劑后，房水中利多卡因的Cmax分別為（10193±4535）ng·mL-1和（11046± 2734）ng·mL-1，AUC0-8分別為7582 ng·h·mL-1和8125 ng·h·mL-1，t1/2分別為2.6 h和1.9 h，Tmax均為0.3 h。結論：鹽酸利多卡因眼用凝膠受試和參比制劑在房水中藥動學特征一致，眼部給藥后利多卡因可快速穿透角膜到達房水，并在房水中達到較高的濃度。

利多卡因；眼用凝膠；房水；藥代動力學；新西蘭兔；LC-MS/MS

鹽酸利多卡因是一種酰胺類局部麻醉藥，被廣泛用于浸潤麻醉、硬膜外麻醉、表面麻醉及神經傳導阻滯。國內眼科手術多使用2%鹽酸利多卡因注射液，目前尚未見專為眼表面麻醉設計的鹽酸利多卡因滴眼液或其他劑型。鹽酸利多卡因眼用凝膠可延長藥物與眼表面接觸時間，改善麻醉效果，減少藥物全身吸收，因此用于眼科操作表面麻醉安全、有效[1-2]。然而，關于鹽酸利多卡因眼部藥代動力學的研究在國內外文獻中尚未報道過，為研究鹽酸利多卡因眼用凝膠的眼部藥代動力學特征，本試驗建立了LC-MS/MS法測定兔眼房水中利多卡因的濃度。

文獻報道檢測利多卡因濃度的方法為HPLC法[3]、高效毛細管電泳法[4]、氣相色譜-質譜法[5]，這些方法靈敏度不高，難以滿足微量濃度的檢測。有文獻報道采用LC-MS/MS法測定利多卡因[6-7]，但樣品處理常用液液萃取，過程相對復雜。本試驗建立的LC-MS/MS法簡化了樣品的前處理過程，靈敏度高，重現性好，符合生物樣品的分析要求。

1 材料

1.1 儀器

Agilent Technologies 6410 Triple Quad LC/MS系統和MassHunter Workstation Software工作站（美國Agilent公司）；Satorious電子分析天平（德國賽多利斯股份有限公司）；HC-2062型臺式高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；CM-1000高速振蕩機（日本東京理化器械株式會社）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸利多卡因眼用凝膠（受試制劑，濟南百諾醫藥科技開發有限公司，批號：20131001，規格：5 mL∶0.175 g）；鹽酸利多卡因眼用凝膠（參比制劑，AktenTM，Akorn Inc，批號：421213，規格：35 mg·mL-1）；利多卡因對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100342-201003，純度99.9%）；來曲唑對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：101045-201101，純度100.0%）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Merck公司）；其余試劑為市售分析純；實驗用水為純凈水。

1.3 實驗動物

選擇72只健康新西蘭兔，體重2.0～2.5 kg，均為雄兔，無眼疾，由南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供，動物生產許可證：SCXK（蘇）2012-0008。本研究的動物飼養、給藥以及生物樣本的采集在中國藥科大學新藥安全評價研究中心進行（動物使用合格證號：0022144）。

2 方法

2.1 色譜條件和質譜條件

色譜柱：Hedera ODS-2 C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-20 mmol·L-1醋酸銨水溶液（含0.1%甲酸）55∶45；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：35℃；進樣量：5 μL。

離子檢測方式：多重反應監測（MRM）；離子極性：正離子（Positive）；離子化方式：電噴霧離子化（ESI）；用于定量分析的離子分別為：利多卡因m/z 235.1→86.1和內標（來曲唑）m/z 286.2→217.1；傳輸區電壓：115 V和115 V；碰撞能量：15 eV和8 eV；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：10 L·min-1；霧化室壓力：40 psi。

2.2 樣品的采集與處理

將72只雄性新西蘭兔隨機分成Ⅰ組和Ⅱ組，每組各36只，再將每組內的36只動物隨機分成12組，每組3只（6只眼睛），每組對應一個采樣時間點。給藥前均需禁食12～24 h，Ⅰ組給予受試制劑，Ⅱ組給予參比制劑，左右眼均滴入15 μL藥液，分別于給藥前及給藥后5、10、20、40 min，1、1.5、2、3、4、6、8 h用頭皮針刺穿角膜，抽取約200 μL房水，于-20℃冰箱中密封保存。

取20 μL房水樣品，加入內標（來曲唑）溶液20 μL（15.48 μg·mL-1），渦旋混勻，再加入1 mL流動相（甲醇∶水=50∶50），渦旋3 min，于15600 r·min-1高速離心5 min，取上清液5 μL進行LC-MS/MS分析。

2.3 數據處理

通過計算房水在同一采樣時間點的所有樣本濃度的平均值，得平均藥物濃度-時間數據，采用DAS 2.0軟件估算房水中利多卡因的主要藥動學參數。

3 結果

3.1 分析方法驗證

3.1.1 方法專屬性在“2.1”項下的色譜和質譜條件下，利多卡因的保留時間為1.8 min左右，內標（來曲唑）的保留時間為3.0 min左右。由圖1可見，利多卡因和內標峰形良好，房水中內源性物質不干擾測定。

圖1 專屬性色譜圖

3.1.2 標準曲線取1.5 mL塑料離心管數支，分別精密加入利多卡因標準溶液，以氮氣流吹干，加入空白房水20 μL，渦旋混勻，配成含利多卡因的濃度為2.070、6.210、20.70、62.10、207.0、621.0、2070、6210、10350 ng·mL-1的標準含藥房水，按“2.2”項下方法處理，進樣，記錄色譜圖。計算利多卡因峰面積As和內標峰面積Ai的比值f（As/Ai），以f對藥物濃度C作權重回歸計算，權重系數w=1/C2，得回歸方程，典型的利多卡因權重回歸方程為：f=0.002357×C+ 0.001363，r2=0.9995。結果顯示，房水中利多卡因濃度在2.070～10350 ng·mL-1范圍內線性關系良好，最低定量限為2.070 ng·mL-1，信噪比大于10。

3.1.3 精密度和準確度依“3.1.2”方法配制含利多卡因濃度分別為2.070、4.140、310.5、8280 ng·mL-1的標準含藥房水，每個濃度平行5份，并制備隨行標準曲線，按“2.2”項下方法處理，進行測定，連續測定3批。將所測結果進行單因素方差分析，計算精密度（RSD）和準確度，結果見表1。本方法的準確度與精密度符合生物樣品分析要求。

3.1.4 基質效應和提取回收率依文獻方法[8-9]考察低、中、高3種濃度（含利多卡因的濃度為4.140、310.5、8280 ng·mL-1）的基質效應和提取回收率，結果見表1。房水中內標來曲唑的回收率為（100.6± 1.4）%（n=15），基質效應為（98.2±3.0）%（n=18）。結果表明，本實驗條件下利多卡因和內標的回收率均良好，房水基質對其離子化無影響。

表1 精密度、準確度、回收率（n=5）和基質效應（n=6）試驗結果

3.1.5 穩定性試驗以4.140、310.5、8280 ng·mL-13種濃度考察利多卡因標準含藥房水的穩定性。結果顯示，利多卡因房水樣品在室溫下放置16.5 h，反復3次凍融及-20℃冰凍21天條件下均穩定性良好；房水樣品處理后的上清液在進樣器中放置18 h穩定性良好。

3.1.6 稀釋準確度試驗依“3.1.2”項配制含利多卡因濃度分別為11154、20280 ng·mL-1的標準含藥房水，每個濃度平行5份，在上述配制好的含藥房水中加入空白房水稀釋5倍，按“2.2”項下方法處理后測定，計算準確度，濃度為11154、20280 ng·mL-1的標準含藥房水稀釋5倍后的準確度分別為（93.3± 1.5）%和（100.4±0.8）%，表明稀釋準確度良好。

3.2 藥代動力學研究

新西蘭兔眼部（左右眼均給藥）分別給予15 μL（35 mg·mL-1）受試制劑和參比制劑后，計算房水在同一采樣時間點的所有樣本濃度的平均值，得平均藥物濃度-時間數據，由此估算房水中利多卡因的主要藥代動力學參數，結果見表2、圖2。比較受試和參比制劑在新西蘭兔房水中的藥動學參數，結果表明，兩制劑在新西蘭兔房水中的主要藥動學參數AUC0-8、AUC0-∞、Cmax、t1/2、Tmax、MRT0-8、CL、Vd基本一致，因此可以判定：兩制劑在新西蘭兔房水中的藥動學特征是一致的。

4 討論

本試驗所建立的LC-MS/MS法樣品預處理簡單，靈敏度高，快速，重現性、專屬性好，能適用于新西蘭兔給予鹽酸利多卡因眼用凝膠后房水中藥代動力學的研究。

利多卡因結構中含有酰胺基團和叔胺基，呈堿性，在流動相中加入適當的添加劑可以改變待測物的保留時間，改善峰形。試驗比較了水相中加酸與不加酸條件下，待測物的色譜行為：不加酸情況下，待測物保留較強，出峰時間在9 min左右，且峰拖尾嚴重；加酸條件下，待測物保留減弱，出峰時間僅1.8 min，且峰形對稱，響應增大。原因可能是利多卡因易與色譜柱上殘存的硅醇基產生作用，從而導致保留增強，峰形拖尾。加酸可以抑制硅醇基的電離，對堿性化合物的保留和峰形均能起到改善作用。同時，試驗還比較了水相中加入甲酸和乙酸條件下，待測物的色譜行為。不同的酸對利多卡因在色譜柱上的保留無影響，但甲酸可使峰形更為尖銳對稱。加入醋酸銨可以穩定水相的pH，對峰形也具有改善作用[10]。

表2 新西蘭兔眼部分別給予15 μL（35 mg·mL-1）受試制劑和參比制劑后房水中利多卡因的藥代動力學參數（n=6）

圖2 新西蘭兔眼部分別給予受試和參比制劑后房水中利多卡因平均濃度-時間曲線（n=6）

兔為眼用制劑研究的首選動物，兔眼與人眼大小、結構相近，因此選用新西蘭兔作為眼部藥動學的試驗對象。房水能夠較客觀地反映藥物在眼內的濃度變化，且在提取時一般能夠準確定量，由實驗操作產生的誤差較小，故本試驗選房水作為眼部藥動學研究的考察樣品[11-13]。

鹽酸利多卡因眼用凝膠說明書中的人用推薦劑量是2滴（100 μL），通過劑量換算，確定本試驗的給藥劑量為15 μL，因此其藥動學參數可以為臨床用藥提供參考依據。

新西蘭兔眼部給予鹽酸利多卡因眼用凝膠后，5 min即可在房水中測得利多卡因，8 h仍可檢測得到，且在兔眼房水中藥物濃度較高。結果表明，鹽酸利多卡因眼用凝膠易被眼組織迅速吸收，且維持時間較長，在兔眼房水中具有良好的藥動學特征和組織通透性，適合用于眼科操作的表面麻醉，值得臨床推廣應用。

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Determination and Pharmacokinetics of Lidocaine in Aqueous Humor after Ocular Administration of Lidocaine Hydrochloride Ophthalmic Gel to Rabbits

LIU Bing1,XU Xiao-wen1,LIN Hong-da1,SUN Cheng-long1,DING Li1*,YOU Lin-jun2
1Department of Pharmaceutical Analysis;2Centre for New Drug Safety Evaluation and Research,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China

Objective：To establish an LC-MS/MS method for the determination of lidocaine in ocular aqueous humor of rabbit and to study the pharmacokinetics of lidocaine hydrochloride ophthalmic gel after a single topical ocular administration.Methods：Seventy-two rabbits were placed in two groups based on the test and reference formulations.Rabbits in each group were instilled with a single 15 μL of lidocaine hydrochloride ophthalmic gel into each eye.Following the sample collection and deproteinization procedures, the lidocaine concentrations in aqueous humor were determined by LC-MS/MS.Letrozole was used as the internal standard and the chromatographic separation was achieved on a Hedara ODS-2 column(5 μm,150 mm×2.1 mm i.d.)with a mobile phase of methanol-0.1%formic acid water solution with 20 mmol·L-1ammonium acetate(55∶45,V/V).The detection was performed using the electrospray ionization(ESI)operating in the positive ion multiple reaction monitoring(MRM)mode.Results：The method demonstrated good linearity ranged from 2.070 to 10350 ng·mL-1with r=0.9995.After administration of the test and reference formulation to the rabbits,the Cmaxvalues were(10193±4535)ng·mL-1and(11046±2734)ng·mL-1,respectively,the AUC0-8values were 7582 ng·h·mL-1and 8125 ng·h·mL-1,respectively,the t1/2values were 2.6 h and 1.9 h, respectively,and the Tmax values were both 0.3 h.Conclusion：There was no significant difference of pharmacokinetic characteristics between the two formulations.Lidocaine hydrochloride ophthalmic gel could rapidly achieve a high concentration in aqueous humor after its topical ocular administration to rabbits.

Lidocaine;Ophthalmic gel;Aqueous humor;Pharmacokinetics;New Zealand rabbits;LCMS/MS

R969.1

A

1673-7806（2014）03-201-04

劉冰，女，碩士生 E-mail:liubing19881027@163.com

*通訊作者 丁黎，男，博士生導師、教授 Tel:025-83271485

E-mail:dinglidl@sina.com

2014-03-18

2014-04-09