高頻電刺激對(duì)大鼠腳橋核神經(jīng)元的影響

【關(guān)鍵詞】高頻電刺激；大鼠；神經(jīng)元；影響

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.05.602文章編號(hào)：1004-7484（2014）-05-2870-02蒼白球（globus pallidus，GP）在大鼠（entopeduncular nucleus，EP）作為基底節(jié)重要的輸出核團(tuán)，與（pedunculopontine nucleus，PPN）有著密切的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)用電刺激的方法觀察大鼠EP對(duì)PPN神經(jīng)元放電的影響，以探討GP-PPN通路對(duì)PPN神經(jīng)元活動(dòng)的影響。

1資料與方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)選用成年SD雄性大鼠10只，體重250-300g，由漯河醫(yī)專(zhuān)科實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物手術(shù)及電刺激大鼠以20%氨基甲酸乙酯0.8ml/100g腹腔麻醉，固定在腦立體定位儀上，行常規(guī)開(kāi)顱術(shù)及腦立體定位術(shù)，并維持正常體溫，保持呼吸道通暢。將刺激電極（NEX100同心圓電極，外徑0.25mm，直流阻抗3-6M8）插入腦內(nèi)EP（坐標(biāo)為AP-2.3mm，LR2.6mm，H7.4mm），為避免刺激電極與記錄電極發(fā)生沖撞，將刺激電極由左向右傾斜16b，以觀察不同刺激頻率對(duì)PPN神經(jīng)元的放電活動(dòng)的影響。電刺激采用A320R隔離刺激器（美國(guó)WPI公司）輸出。刺激參數(shù)為：?jiǎn)蚊}沖，強(qiáng)度0.6mA，波寬0.06ms，刺激時(shí)程5s，刺激頻率分別為5、10、20、50、100、150、200Hz。

1.2.2細(xì)胞外記錄PPN神經(jīng)元放電采用自制的單管玻璃微電極進(jìn)行細(xì)胞外記錄。借助微電極推進(jìn)器將微電極緩緩插入PPN（AP-7.3-8.0mm，LR1.5-1.8mm，H6.0-6.5mm）。神經(jīng)元單位放電經(jīng)微電極放大器采集、濾波并顯示于示波器上，輸入計(jì)算機(jī)處理，再現(xiàn)原始波形，同時(shí)生成序列密度直方圖。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中只對(duì)放電幅度穩(wěn)定且信噪比>3/1的神經(jīng)元放電信號(hào)進(jìn)行記錄。

1.2.3組織學(xué)檢測(cè)每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，玻璃微電極通以（-20LA，20min）電流，將滂胺天藍(lán)泳入，以標(biāo)記記錄部位，刺激部位采用直流電毀損法標(biāo)記。然后用生理鹽水和含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖液各50ml經(jīng)頸動(dòng)脈灌流行前固定15-20min，迅速取出完整的腦組織，放入同樣的固定液中進(jìn)行后固定至少4h，再將腦組織移入30%的蔗糖磷酸緩沖液（pH=7.4）中過(guò)夜，沉底后即可行冰凍切片，片厚30Lm，焦油紫染色，光鏡下觀察進(jìn)行組織學(xué)鑒定。只對(duì)刺激和記錄部位均正確的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，神經(jīng)元的平均放電頻率以（χ±s）表示，施加各處理因素前后差異性比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1正常大鼠PPN神經(jīng)元的自發(fā)放電實(shí)驗(yàn)共記錄了33個(gè)PPN神經(jīng)元自發(fā)放電活動(dòng)，其放電頻率在3.6-52.2Hz之間，平均為（15.95±8.56）Hz。PPN神經(jīng)元表現(xiàn)為三種放電形式：規(guī)則放電、不規(guī)則放電和爆發(fā)式放電。其中多數(shù)為規(guī)則放電（69.69%），其次是不規(guī)則放電（30.43%），爆發(fā)式放電所占比例最小（9.09%，3/33）。

2.2不同頻率電刺激EP對(duì)PPN放電活動(dòng)的影響共記錄了不同頻率電刺激EP（5、10、20、50、100、150、200Hz）對(duì)33個(gè)PPN神經(jīng)元放電活動(dòng)的影響。電刺激EP對(duì)PPN神經(jīng)元放電活動(dòng)的影響表現(xiàn)為放電頻率的減少、增多和無(wú)明顯變化三種形式。低頻電刺激（5-10Hz）大鼠EP時(shí)，PPN神經(jīng)元的自發(fā)放電無(wú)明顯變化（P>0.05），隨著刺激頻率的增加（20-200Hz），使PPN神經(jīng)元自發(fā)放電活動(dòng)表為抑制數(shù)量增加。

3討論

腦深部電刺激（deep brain stimulation，DBS）的主要靶點(diǎn)有STN等。但這些部位的DBS并不能很好地改善步態(tài)障礙、運(yùn)動(dòng)不能和姿勢(shì)異常等癥狀。而電刺激PPN可改善PD的步態(tài)障礙等癥狀，很可能成為治療PD新的刺激靶點(diǎn)[1]。但其機(jī)制仍不楚。PPN與基底神經(jīng)節(jié)有著密切的聯(lián)系，尤其是PPN接受黑質(zhì)網(wǎng)狀部（substantia nigra reticular，SNr）和蒼白球內(nèi)側(cè)部globus pallidus internus，GPi）的GABA能抑制性投射纖維和來(lái)自STN的Glu能興奮性投射纖維[2]。兩條傳入通路活動(dòng)的平衡是維持PPN正常功能的必要條件。PPN發(fā)出的下行投射纖維至腦橋延髓網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和脊髓。動(dòng)物研究表明PPN在運(yùn)動(dòng)的起始、加速、減速和終止過(guò)程中起重要作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，電刺激EP時(shí)大多數(shù)PPN神經(jīng)元的自發(fā)放電活動(dòng)受抑制，在100Hz時(shí)的抑制作用最強(qiáng)。解剖學(xué)研究證實(shí)GPi的GABA能神經(jīng)纖維直接投射到PPN，而微電泳GABA可抑制PPN神經(jīng)元的放電活動(dòng)，并具有緊張性作用。依此可推測(cè)電刺激EP時(shí)，由于GABA釋放增多，增加了對(duì)PPN的抑制性作用，從而抑制了PPN神經(jīng)元的活動(dòng)，使其放電頻率降低。電生理實(shí)驗(yàn)顯示，在6-OHDA損毀黑質(zhì)DA能神經(jīng)元后，PPN神經(jīng)元自發(fā)放電頻率明顯高于正常的大鼠。代謝研究也顯示，PD模型鼠和猴PPN的2-脫氧葡萄糖重吸收增加，反映了STN的興奮性遞質(zhì)和GPi/SNr的抑制性遞質(zhì)在PPN的作用增強(qiáng)。推測(cè)PD時(shí)，興奮性和抑制性輸入的失衡很可能會(huì)導(dǎo)致PPN的活動(dòng)異常。

抑制PPN神經(jīng)元可抑制基底神經(jīng)節(jié)的輸出，達(dá)到改善PD運(yùn)動(dòng)障礙的作用。在正常大鼠PPN也可能通過(guò)多突觸傳遞，經(jīng)SNc的間接影響，對(duì)STN起抑制性的調(diào)節(jié)作用[3]。且束旁核有到STN、紋狀體和蒼白球的興奮性投射，PPN也可能通過(guò)腳橋核-束旁核間接通路來(lái)調(diào)節(jié)STN的活動(dòng)[4]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PPN神經(jīng)元的放電活動(dòng)與STN的Glu能和GPi/SNr的GABA能傳入投射的綜合作用有著密切的關(guān)系。PD時(shí)，大鼠PPN神經(jīng)元放電頻率的增多，可能是STN的興奮性傳入作用強(qiáng)于GPi的抑制性傳入作用的結(jié)果。GPi-PPN傳入神經(jīng)通路活動(dòng)的改變參與PD的生理過(guò)程。

參考文獻(xiàn)

[1]Pienaar IS，Elson JL，Racca C，et al.Mitochondrial abnormality associates with type-specific neuronal loss and cell morphology changes in the pedunculopontine nucleus in Parkinson disease[J].Am J Pathol，2013，183（6）：1826-1840.

[2]Peppe A，Pierantozzi M，Baiamonte V，et al.Deep brain stimulation of pedunculopontine tegmental nucleus：role in sleep modulation in advanced Parkinson disease patients：one-year follow-up[J].Sleep，2012，35（12）：1637-1642.

[3]Mazzone P，Insola A，Valeriani M，et al.Uncertainty，misunderstanding and the pedunculopontine nucleus：the exhumation of an already buried dispute[J].Acta Neurochir（Wien）.，2012，154（8）：1527-1529.

[4]Mazzone P，Sposato S，Insola A，et al.A commentary on the lead positioning for deep brain stimulation in the pedunculopontine tegmental nucleus in a patient affected by multiple system atrophy[J].Stereotact Funct Neurosurg，2012，90（2）：130-133.