肝素結合蛋白在大鼠腦缺血再灌注損傷中的表達及意義

【關鍵詞】 腦缺血再灌注損傷；肝素結合蛋白；大鼠

【中圖分類號】R245.31 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）09-0145-01

肝素結合蛋白（HBP）作為多形核白細胞分泌的重要顆粒蛋白，因其具有顯著的殺菌活性、趨化特性以及炎癥調節作用，越來越引起研究者的重視。多項研究表明，HBP與感染性疾病相關蛋白有關聯，相互作用參與多種因素誘導細胞凋亡。因此，HBP究竟在腦缺血再灌注損傷的發病機制中發揮怎樣的作用？國內外鮮為報道。本文通過檢測大鼠腦組織I/R損傷后腦組織HBPmRNA及Caspase-1mRNA的動態表達及神經元細胞的凋亡，旨在研究HBP在大鼠腦I/R損傷中的作用及意義。

1 材料與方法

1. 1 動物模型制備 健康雄性SD大鼠40只，體質量為（400±20）g，由南華大學動物實驗部提供。隨機分為假手術組（8只）和腦缺血再灌注組（32只）。后者再分為再灌注6、12、24及72h四組（n=8）。采用改良的Longa線栓法建立大鼠局灶腦缺血再灌注損傷模型。具體步驟參考陸伶俐的研究方法。假手術組除不插入線栓外，余處理相同。每組隨機取8只大鼠于不同時間窗麻醉后立即處死.迅速在冰臺上分離出海馬組織并置于液氮中保存。組織用于RT-PCR檢測。

1. 2 腦組織HBPmRNA及Caspase-1mRNA的測定

腦組織HBP、Caspase-1基因采用實時熒光RT-PCR分析：引物序列及擴增反應條件見表1及表2，不同時間窗提取腦組織總RNA，cDNA的合成嚴格按照試劑盒操作步驟進行。PCR產物瓊脂糖凝膠電泳后，以UVP計算機圖像掃描分析系統測定電泳條帶A值，以β-actin為內參照，計算HBP及Caspase-1mRNA相對水平，結果以分別HBP及Caspase-1mRNA條帶與β-actin條帶A的比值表示。

1.3 細胞凋亡的檢測 末端原位標記（ TUNEL）試劑盒購自德國寶靈曼公司，操作按說明書步驟進行。光學顯微鏡下神經元胞核中有棕黃色顆粒的為TUNEL陽性細胞。每張切片于梗死灶周圍選擇10個表達最強的HP計數TUNEL陽性細胞數，取平均值。

1.4 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件， 數據以？x±s表示，采用One-Way ANOVA檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 不同時相腦缺血再灌注模型大鼠組織HBPmRNA、Caspase-1mRNA的表達及及TUNEL陽性細胞數的比較

大鼠腦I/R損傷組各組均可見到明顯的細胞凋亡且假手術組中未見到TUNEL陽性細胞。腦I/R損傷后6h即有細胞凋亡，于72h達到高峰；假手術組中Caspase-1mRNA有少許表達。腦I/R損傷后隨I/R時間延長其表達逐漸上升，于72h達到高峰，與假手術組比較差異有統計學意義（P < 0. 05）；腦I/R損傷后HBPmRNA表達隨I/R時間延長其表達逐漸上升，于72h達到最高值，與假手術組比較差異有統計學意義（P < 0. 05）。見表1.

2. 2 相關性分析

腦缺血再灌注模型大鼠組織HBPmRNA表達與Caspase-1mRNA表達呈正相關（r=0.32，P<0. 05）。

3 討論

凋亡在腦缺血/再灌注損傷發病機制中的發揮關鍵的作用。Caspase-1蛋白激活細胞內信號轉導通路而執行細胞凋亡。Caspase-1蛋白激活后破壞細胞完整性，損壞DNA鏈，最后啟動程序性凋亡。本實驗發現，大鼠腦I/R12h時Caspase-1mRNA表達至高峰，隨著時間延長其表達呈上升趨勢，結合神經元細胞凋亡率在I/R后72h至高峰，提示I/R后Caspase-1mRNA表達上調促進了細胞凋亡。

早期的研究證實HBP進入細胞后聚集在線粒體區域，通過與經典的死亡受體平行的線粒體途徑參與調節細胞凋亡，這與細胞的應激反應一致。該過程考慮可能與線粒體外膜的Bcl-2、Bax、Bak有關[1]。本實驗中，我們觀察到腦I/R組BHPmRNA表達上升，于I/R72h最高，并且腦I/R組中BHPmRNA表達與S組相比各時點均明顯升高，提示BHPmRNA表達升高與腦缺血再灌注損傷的耐受性降低密切相關。同時本研究發現，腦缺血再灌注模型大鼠組織BHPmRNA表達與Caspase-1mRNA表達呈正相關，提示兩者存在相互作用或正性調節作用從而加速病情的惡化和進展。

因此，深入的研究HBP分子的作用機理，尤其在減輕腦缺血再灌注后的凋亡作用機制的不斷明確，將為臨床的治療和開發提供更多、更有效的藥物靶點治療。

參考文獻

[1]王亮，馬曉春. 肝素結合蛋白的結構和功能特點及其在膿毒癥中的作用 [J].中華危重病急救醫學雜志，2012，26（3）：200-203.