滇桂艾納香膠囊微生物限度檢查法驗證研究

摘要：建立滇桂艾納香膠囊的微生物限度檢驗方法。采用常規法對樣品進行方法驗證。結果五種規定試驗菌的回收率均不低于70%，可用于滇桂艾納香膠囊的微生物限度檢驗。

關鍵詞：滇桂艾納香膠囊；微生物限度檢查；方法驗證 【中圖分類號】R285 【文獻標識碼】B 【文章編號】1672-8602(2014)03-0197-01

滇桂艾納香膠囊具有活血化瘀，止血調經。用于瘀血阻滯所致的月經量多，經期延長。主要成份為滇桂艾納香。根據其制劑用藥途徑，應進行細菌數、霉菌和酵母菌數的測定、及控制菌——大腸埃希菌檢查。經實驗研究，確定采用常規法進行細菌數、霉菌和酵母菌數、大腸埃希菌檢查。經對所確定的方法進行驗證，符合2010年版《中國藥典》一部附錄ⅧC有關微生物限度檢查法有關規定，方法可行。

1 實驗儀器、試藥

1.1 實驗菌種:枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501、金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、大腸埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003。

1.2 樣品：風濕靈片

1.3 培養基及稀釋劑:營養瓊脂培養基，玫瑰紅鈉瓊脂培養基，營養肉湯培養基，膽鹽乳糖培養基（BL），改良馬丁培養基，MUG培養基，曙紅亞甲藍瓊脂培養基， pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，0.9%無菌氯化鈉溶液等。

1.4 儀器:培養箱、高壓蒸汽滅菌器等。

2 細菌數、霉菌和酵母菌數測定方法的建立及驗證

2.1 菌液制備:取經35℃培養18～24h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的營養肉湯培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1ml含菌數為50～100cfu的菌懸液，備用；取經25℃培養24～48h的白色念珠菌液體培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1ml含菌數為50～100cfu的菌懸液，備用；取經25℃培養1周的黑曲霉斜面培養物，加10 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸取菌液用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1ml含菌數為50～100cfu的菌懸液，備用。

2.2 供試液的制備方法:常規法：取樣品10g，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成1：10的供試液；取1：10的供試液1ml注皿。

2.3 回收率試驗:試驗組：同2.2，另分別取各試驗菌50～100CFU，分別注入同一平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度，細菌培養24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培養48～72h。菌液組：取試驗菌50～100CFU注入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度，細菌培養24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培養48～72h，測定所加入的試驗菌數，平行制備2個平皿。供試品對照組：同2.2，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度，細菌培養24～48h，霉菌和酵母菌培養48～72h，測定供試品本底菌數。

2.4 方法的確定:選用金黃色葡萄球菌、白色念珠菌作為敏感菌株進行預試驗，結果：金黃色葡萄球菌回收率為93%，白色念珠菌回收率為86%，表明風濕靈片對細菌、真菌沒有抑制作用，采用常規法進行細菌數、霉菌和酵母菌數測定可行。pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋劑無抑菌作用，對實驗無干擾。

2.5 細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證:取3個批號滇桂艾納香膠囊樣品，細菌數、霉菌及酵母菌數按常規法進行加菌回收率試驗，結果見表1

批號 回收率

大腸埃希菌 枯草芽孢桿菌 金黃色葡萄球菌 白色念珠菌 黑曲霉

11030180% 84% 90%98% 85%

11040190%94%92% 93% 100%

11050195%90% 92% 90%96%

三個批號樣品的驗證試驗結果表明，以常規法進行滇桂艾納香膠囊細菌數、霉菌及酵母菌數測定，五種規定試驗菌的回收率均大于70%，符合《中國藥典》的規定，方法可行。確定滇桂艾納香膠囊細菌數、霉菌及酵母菌數計數方法為常規法。

3 控制菌檢驗方法的建立及驗證

菌液制備同2.1。

3.1 大腸埃希菌檢查方法:常規法：取1：10供試液10ml接種至100ml膽鹽乳糖培養基，同時加入大腸埃希菌10～100CFU，35℃培養24～48h。取培養物0.2ml接種至含5ml MUG培養基的試管中，35℃培養24h左右，366nm紫外燈下觀察熒光，然后進行靛基質試驗，觀察結果；另取培養物劃線接種于曙紅亞甲藍（EMB）平板，35℃培養18～24h，觀察其菌落形態。

3.2 大腸埃希菌試驗結果:經膽鹽乳糖（BL）培養基培養后，試驗組與陰性對照組相比較有明顯的變化，試驗組有明顯產酸產氣現象，結果如表2

大腸埃希菌 試驗組 陽性對照 陰性對照

BL - + ―

MUG，靛基質 - - + ―

EMB平板 -+―

4 結語

根據上述實驗結果，擬定滇桂艾納香膠囊微生物限度檢查法標準正文如下：微生物限度 照微生物限度檢查法（《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪJ）。取本品10g，用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液制成1：10的供試液。細菌數、霉菌和酵母菌數、大腸埃希菌 取1：10的供試液，采用常規法，依法檢查，應符合規定。細菌數每1g不得過1000cfu，霉菌和酵母菌數每1g不得過100cfu，大腸埃希菌每1g不得檢出。

5 三批滇桂艾納香膠囊的微生物限度檢查

按上述所建立的滇桂艾納香膠囊微生物限度檢查法，對三批樣品進行檢驗，結果見表3

批號 細菌數霉菌、酵母菌數 大腸埃希菌 結論

110301 120個/g15個/g 未檢出 符合規定

110401 80個/g10個/g 未檢出 符合規定

110501 90個/g 20個/g未檢出 符合規定

參考文獻

[1] 2010年版《中國藥典》一部.