局部深低溫對脊髓損傷大鼠神經再生和硫酸軟骨素蛋白多糖mRNA表達的影響

摘要：目的 探索局部深低溫對脊髓損傷大鼠硫酸軟骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs)基因表達和軸突再生的影響。方法 54只成年SD大鼠被隨機分為三組：假手術組（n=6），脊髓損傷組（n=24）和脊髓損傷+低溫組(n=24)，建立動脈瘤夾鉗夾脊髓損傷模型，在使用硬膜外灌流裝置保持干預組低溫狀態120min后，緩慢復溫至37℃。通過Realtime-PCR 檢測脊髓損傷大鼠傷后NG2 、neurocan和Brevican的表達，通過LFB染色觀察大鼠脊髓脫髓鞘程度并使用大鼠后肢BBB評分評估局部低溫對于脊髓損傷后運動功能恢復的影響。結果 ng2、Neurocan的mRNA表達在傷后8d左右（Brevican 14d）達到高峰，與損傷組相比，低溫組在傷后8d和14d的表達水平顯著降低(P<0.05)，脫髓鞘及空泡化程度降低，并獲得了較高的BBB評分（P<0.05）。結論 局部低溫能夠促進脊髓損傷后運動功能的恢復，這種作用可能與局部深低溫下調了硫酸軟骨素蛋白多糖的基因表達有關。

關鍵詞：深低溫；脊髓損傷；軸突再生；硫酸軟骨素蛋白多糖

Effects of Regional Profound Hypothermia on Axon Regeneration and Chondroitin Sulfate Proteoglycans' mRNA

Expression in Rats with Spinal Cord Injury

XU Xiao-yu1，2，CHENG Hui-lin1

(1.School of Medicine，Nanjing University ，Nanjing 210002，Jiangsu，China;2.Department of Neurosurgery，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region，Nanjing 210002，Jiangsu，China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of regional profound hypothermia on the mRNA expressions of chondroitin sulfate proteoglycans (CSPGs) and axon regeneration in adult rats with spinal cord injury. Methods56 rats were randomly assigned into sham-operated (n=6)， spinal cord injury (SCI) (n=24)， SCI+Hypothermia (n=24) groups. Spinal cord injury models were established by clamped on T10 with aneurysm clip. An epidural perfusion device was applied to maintain a steady temperature (18℃) for 120min with gradual re-warming to 37℃. The mRNA expressions of NG2， Neurocan and Brevican were tested by real-time PCR. The Luxol Fast Blue (LFB) stain were used to observe the morphology features of spinal cord. The motor function of hind limbs (BBB score) was monitored for 21 days. ResultsThe mRNA expressions of NG2， Neurocan， Brevican were significantly downregulated by hypothermia at 8D and 14D after spinal cord injury(P<0.05)， an alleviated demyelinating condition was observed in rats received RH， in addition， the SCI+Hypothermia group got a higher BBB score compared with the SCI group(P<0.05). ConclusionThe regional profound hypothermia could promote the recovery of locomotors' function after SCI， which may be caused by the downregulation of CSPGs.

Key words：Spinal cord injury; Hypothermia; Axon regeneration; Chondroitin sulfate proteoglycans (CSPGs)脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）作為一種伴發多種并發癥[1]的嚴重的中樞神經系統損傷，在當代社會的發病率逐年升高，給個人、家庭及社會造成了嚴重的負擔。低溫作為一種公認的具有神經保護作用的治療手段，在脊髓損傷的治療中逐漸顯現出重要的作用，但是關于低溫神經保護作用的機制仍未完全了解。

硫酸軟骨素蛋白多糖是一種廣泛存在于中樞神經系統基質中的分子物質，其在神經的發育、成熟及損傷后的生理、病理過程中都起到了舉足輕重的作用。在中樞神經系統損傷后，GSPGs可以在膠質瘢痕中富集并阻止神經的再生[2-3]。

1資料與方法

1.1一般資料雄性SD大鼠54只，體重220~250g，其中假手術組6只，脊髓損傷組24只，脊髓損傷+低溫組24只。制作脊髓損傷及低溫模型。

1.2方法大鼠分為假手術組、損傷組和損傷+低溫組（每組大鼠6只）。使用Mx3000p系統行RNA擴增。從損傷組和低溫組每組隨機選取6只大鼠，取傷灶處脊髓組織制備橫斷面的石蠟切片（8mm）。按標準步驟行堅牢藍染色。術后后肢運動功能評價使用BBB運動評分表。由2位觀察員進行盲法評分。

1.3統計分析應用SPSS 19．0統計軟件分析，數據以均數±標準差(x±s)表示，兩組之間比較采用兩獨立樣本t檢驗。

2結果

2.1 NG2， Neurocan和Brevican mRNAs 的表達變化 除了Brevican 之外，NG2和Neurocan的mRNA水平在損傷后2d開始升高，8d左右達到峰值，brevican的mRNA水平在傷后2d有一定的降低，然后逐漸升高，在14d左右達到一個相對較高的水平，與損傷組相比，低溫組的mRNA水平均有所降低（NG2 2D P<0.01，8D P<0.01，16DP<0.05；Neurocan 8D P<0.05，16D P<0.01；Brevican 2DP<0.05，8D P<0.05，16D P<0.05）。見圖1。

2.2 LFB染色 傷后21d觀察兩組的脫髓鞘情況，兩個代表性視野取自脊椎后角處，與損傷組（左圖）相比，低溫組（右圖）的脫髓鞘和空泡化程度明顯降低。見圖2。

圖2LFB染色（箭頭為空泡化改變 400倍視野）

2.3后肢運動功能評分對照組各時間點評分均為滿分21分；低溫組大鼠的后肢BBB評分在7d（SCI+Hypothermia 9.15±1.02；SCI 6.33±0.58 P ＜0.05）、14d（SCI+Hypothermia 13.25±1.26；SCI 9.75±0.96 P＜0.01）和21d（SCI+Hypothermia 15.25±1.32；SCI 12.25±0.86 P＜0.05）明顯高于損傷組。

3討論

全身低溫不僅增加了心律失常和肺炎的發生率，而且能夠引起像寒戰、免疫抑制和凝血障礙等嚴重后果[1]。而局部低溫能很大程度上避免上述并發癥的出現。在本實驗中，我們使用了硬膜外低溫生理鹽水灌注來誘導局部深低溫，該種方法能快速（10min內）將傷灶處溫度降低到理想水平（18℃），并通過調節液體的灌流速度使低溫維持穩定長達2h，這些都說明了在未來的脊髓損傷治療中，硬膜外局部深低溫可以作為一種穩定的、可靠的治療方式在臨床上使用。

膠質瘢痕和 CSPGs是C N S受損后神經元軸突再生的主要抑制分子，本研究發現局部深低溫可以下調脊髓損傷后幾種主要的硫酸軟骨素蛋白多糖的基因表達，在脊髓損傷后，CSPGs可以通過與其受體結合，通過不同的信號通路激活RhoA-ROCK，最終引起對軸突再生的抑制[5]，我們推斷低溫可以通過減少NG2等CSPGs的基因表達，繼而減少其下游效應分子的激活，減輕了其對神經再生的抑制作用。

4結論

局部深低溫可以減輕大鼠脊髓損傷后的脫髓鞘程度，同時促進后肢運動功能的恢復，這些保護作用可能與低溫下調CSPGs的表達有關。局部深低溫作為一種具有明確神經保護作用的、并發癥較少的干預措施，具有較高的臨床應用價值。

參考文獻：

[1]李景偉，馮世慶，焦新旭，等.急性脊髓損傷患者早期并發癥及危險因素分析[J].中國脊柱脊髓雜志，2011，21(7):569-572.

[2]Bartus K， James ND， Bosch KD， Bradbury EJ. Chondroitin sulphate proteoglycans: key modulators of spinal cord and brain plasticity [J]. Exp Neurol，2012，235(1):5-17.

[3]Sharma K， Selzer ME， Li S. Scar-mediated inhibition and CSPG receptors in the CNS [J]. Exp Neurol，2012，237(2):370-378.

[4]Davies SJ， Fitch MT， Memberg SP， Hall AK， Raisman G， Silver J. Regeneration of adult axons in white matter tracts of the central nervous system [J]. Nature，1997，390(6661):680-683.

編輯/哈濤