酶聯免疫斑點試驗在結核性腹腔積液診斷中的應用

摘要：目的 運用聯免疫斑點試驗（ELISPOT）法對結核性腹腔積液進地診斷，并探討其應用價值。方法 對62例明確診斷為結核性腹腔積液及54例惡性腫瘤性腹腔積液（對照組）分離其中單個核細胞，采用TB-ELISPOT法檢測其結核菌抗原特異性T淋巴細胞反應，同時對腹腔積液TB-DNA采用熒光定量PCR法檢測，并比較兩種方法的特異性和靈敏度。結果 TB-ELISPOT法及TB-PCR法檢測腹腔積液，其靈敏度分別為93.5%、64.5%，兩種方法相比較差異有顯著性統計學意義 (χ2=15.1，P<0.01)；兩種方法檢測的特異性分別為94.4%、85.2%，經比較，差異無統計學意義(χ2=1.49，P>0．05)。結論 TB-ELISPOT法對腹腔積液進行結核分枝桿菌檢測靈敏度高、特異性好，是一種較為理想的實驗室輔助診斷方法。

關鍵詞：酶聯免疫斑點試驗；腹腔積液；結核；診斷腹腔積液在臨床上較為常見，以往對于結核性腹腔積液的實驗室檢查多采用涂片找抗酸桿菌及PCR法檢測結核桿菌，但這些方法靈敏度不夠理想，近年來也有很多文獻報道了采用ADA、CEA對鑒別結核性、癌性胸腹腔積液的應用價值，但而這些方法特異性較差，特別是40歲以上的結核性與癌性腹腔積液的鑒別較為困難[1]。

酶聯免疫斑點試驗（ELISPOT）是由Czerkinsky等于1983年建立的一種對于單細胞水平分泌特異性抗體的新免疫學方法，以后運用于檢測分泌細胞因子的抗原特異性T淋巴細胞的數量。由于結核桿菌可以誘導T淋巴細胞產生細胞免疫反應，Lalvani等首先將ELISPOT法用于結核診斷，以往曾有關于ELISPOT法檢測血液中特異性T淋巴細胞的報導[2]。本文對腹腔積液采用ELISPOT法檢測，并探討其在對結核性腹腔積液診斷價值。

1資料與方法

1.1一般資料2011年8月~2012年10月我院住院患者，共116例。根據實驗室檢查、影像學、病理結果及檢臨床表現確診為結核性腹膜炎患者62例，年齡17～51歲，平均年齡33歲。對照組為54例惡性腫瘤患者，年齡25～54歲，平均34歲。臨床醫師腹穿采集腹腔穿刺液標本。

穿刺液用EDTA-K2進行抗凝后，取8ml穿刺液并使用Ficoll-Hypaque進行密度梯度離心分離其中的單個核細胞。分離后的單個核細胞于-80℃環境下貯存。

1.2試劑與儀器熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)TB-DNA試劑購于達安基因生物公司，儀器為ABI 7300熒光定量PCR儀。Cryostar凍存液及結核桿菌TB-ELISPOT試劑盒購于北京達科為生物技術公司。

1.3對穿刺液沉淀提取物進行結核桿菌DNA PCR檢測，按照試劑盒說明書進行擴增30個循環后，通過ABI 7300PCR分析儀軟件分析判斷，并報告TB-DNA拷貝數量，當DAN含量>103考貝/ml時為陽性。

1.4 ELISPOT法為貯存一定數量后批量檢測。PCR法對送檢后穿液抗凝離心后取沉淀物對單個或多個標本分次檢測。TB ELISPOT檢測運用ESAT-6（結核早期分泌抗原靶分子）和CFP-10(培養濾液蛋白10)兩種抗原刺激，本試驗在已包被抗體的孔中直接刺激細胞采用直接ELISPOT法，以PHA為陽性對照刺激物，每孔加樣100 ul，加入的單個核細胞經重懸液濃度為2～5×106/100ul， 按試劑盒說明進行其具體操作，檢測結果亦依據試劑盒說明的標準判讀。

1.5統計方法使用SPSS 12.0統計軟件，運用χ2檢驗對兩種方法的檢測結果的特異性及靈敏度進行分析比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

采用ELISPOT法對62例結核患者的穿刺液檢出陽性58例，采用PCR法檢出陽性40例，兩種方法的靈敏度比較P<0.01，其差異具有顯著性統計學意義，見表1。

對54例作為陰性對照惡性腫瘤患者的穿刺液分別采用ELISPOT法及PCR法，兩者特異性分別為94.4%和85.2%，兩種方法的特異性比較P>0.05，差異無統計學意義，見表2。

3討論

本文通過對腹腔穿刺液選取TB-PCR法及ELISPOT法進行檢測并比較。TB-EIISPOT法使用重組CFP-10和ESAT-6，這兩種蛋白具有和天然蛋白相同抗原性，可使結核桿菌再感染的記憶性效應T淋巴細胞增殖并產生大量INF-γ。本文所采用的ELISPOT法利用結核桿菌感染者腹腔積液中存在結核菌特異的活化T細胞，培養液中加入ESAT-6和CFP-10為結核桿菌特異混合抗原，刺激這些效應T淋巴細胞分泌γ干擾素。其分泌的INF-γ被微孔板上的特異抗體所捕獲，再次加入的堿性磷酸酶標記的抗體針對INF-γ不同表位結合，并滯留于微孔板表面。底物溶液顯色并在反應部位被酶分解后形成不溶性色素沉淀斑。斑點數代表γ干擾素分泌細胞數量。對斑點進行計數后可以檢測腹腔液內是否存在對核菌反應的效應T細胞，從而輔助診斷結核桿菌感染情況。與ELISA相比，ELISPOT法更靈敏，它可以從20萬-30萬單個核細胞中檢出一個分泌該蛋白的細胞。

以往有文獻采用PCR法檢測胸腹水中TB-DNA[3]，本實驗對腹腔積液用TB-ELISPOT法與TB-PCR法相比，結果表明EIISPOT具有較高敏感性。使用的結核桿菌培養濾液蛋白CFP-10和特異性抗原多肽ESAT-6，其特異性良好，可達94.4%。并且可以避免接種卡介苗(BCG)及其他分枝桿菌感染的交叉反應，只要對其中一種多肽的T細胞反應達到要求就可判讀為陽性[4]。以往對于結核性腹膜炎的診斷多根據臨床特點及影像學檢查，而本實驗采用對腹腔液分離其中的單個核細胞進行結核桿菌EIISPOT法檢測，這樣可以直接地進行結核性感染的診斷，具有很好的特異性及敏感性，是一種較為理想的實驗室輔助診斷方法。

參考文獻：

[1]谷旭紅，閻振元，周清龔，等.腺苷脫氨酶與癌胚抗原的測定在結核性與癌性胸水鑒別診斷中的意義[J].河南診斷與治療雜志，2002， 7（6）：402-403.

[2]LalvaniA，PathanAA，McShaneH，et a1.Rapid detection of Mycobacterium Tuberculosis infection by enumeration of antigen specific T cells[J]. Am J Respir Care Med，2001，163(4):807-808．

[3]孫慶.熒光定量聚合酶鏈反應快速檢測胸腹水抗酸桿菌的臨床應用[J].國際檢驗醫學雜志，2011，32（13）：1479-1480.

[4]Philip C，Dolly Jackson-Sillah，Annette Fox，el a1．ESAT-6/CFP-10 Fusion Protein and Peptides for()primal Diagnosis of Mycobacterium Tuberculosis Infection by Ex Vivo Enzymelinked in Gambia[J]．J Clin Microbiol，2005，43(5)：2070-2074．

編輯/哈濤