體內移植的骨髓間充質干細胞加速大鼠體內損傷胃粘膜的修復

目前，質子泵抑制劑（PPIs）被認為是保護胃粘膜損傷的最有效的藥物之一。然而，有越來越多的數據顯示長期應用PPIs類藥物治療和胃黏膜內的細菌過度生長以及社區獲得性肺炎有一定關聯。此外，一些胃潰瘍甚至在消除幽門螺旋桿菌或者使用非甾體類消炎藥后未痊愈。因此，損傷的胃黏膜需要新的替代療法進行治療。

1資料與方法

1.1一般資料 在這項研究中使用的雄性和雌性Wistar大鼠（8周齡）購自中國解放軍總醫院實驗動物中心。這些大鼠在無病原體的條件下培育和保護。雄性大鼠作為BMMSCs的捐助者，雌性大鼠用吲哚美辛誘導，具有胃潰瘍。按照中國國家實驗動物的使用和保養指南以及中國解放軍總醫院護理委員會的批準進行動物實驗。

1.2方法

1.2.1 BMMSCs的準備，流式細胞儀分析， CFDA SE染色 使用珀-Paque加的密度梯度離心機分離雄性大鼠的BMMSCs。骨髓懸浮液由Wistar大鼠的股骨和脛骨沖洗的內容物制備。這些細胞通過70微米尼龍篩進行篩分，并用培養基洗滌兩次后，骨髓細胞懸浮液用5 mL磷酸鹽緩沖液中的溶質（PBS）稀釋，慢慢地轉移到珀- Paque加，這些材料在2000轉/分鐘的條件下分離25 min。把單核細胞環收集起來，然后用2 mL的Dulbecco改良的Eagle培養基低葡萄糖，在1000轉/min的條件下5 min，轉2次。然后將細胞懸浮于10％胎牛血清、100 IU/mL青霉素，100 IU/mL的鏈霉素（Sigma公司）的5 mL DMEM-LG中，在每個密度為1×107個細胞的培養皿中接種于25 cm2的燒瓶。經過3 d 5％ CO2，37°C的培養，非粘性的造血干細胞被拆除，更換培養基。通過流式細胞儀對BMMSCs進行了表征。>98％的細胞表達CD90，一個具體的胸腺淋巴細胞的標志，>59％的細胞表達了特定標志物表面粘附分子CD44。與此相反，其中有很少CD31陽性的內皮細胞或CD45陽性白細胞。

1.2.2胃潰瘍的動物模型和BMMSCs移植 禁食24 h后，用消炎痛（ 30mg/kg）皮下注入大鼠誘導胃潰瘍。57個雌性健康Wistar大鼠隨機分為三組：I組，胃潰瘍+ PBS組（n=18），組II，胃潰瘍+BMMSCs（n=18）和III組，控制+BMMSCs（n=18）。標記的BMMSCs以濃度1×107 cells/mL通過尾靜脈注射移植。

1.3檢測CFDA SE標記的BMMSCs 在BMMSCs注射24 h，48 h和72 h后獲得胃黏膜組織。5 μm冰凍切片做好后，在熒光顯微鏡下直接放置。選擇激發波長為488 nm，發射部分。

1.4性別決定區Y（SRY）基因（POD）的原位雜交技術 按照以前的一份報告進行原位雜交。簡言之，石蠟包埋的組織切片二甲苯中脫蠟后在酒精水化。這些部分在3 mL/L H2O2培養以阻斷內源性過氧化物酶的活性，每一部分用大鼠/小鼠SRY基因探針（BSCX科技有限公司，中國）進行雜交，漂洗然后根據制造商的說明用DAB著色。最后，將切片用蘇木精復染（Sigma化學，圣路易斯，密蘇里州）。核內有顯著棕黃色顆粒則是陽性。

1.5潰瘍指數（UI ）分析 BMMSCs注射24 h，48 h和72 h后胃進行解剖。立即將動物處死，取出胃，沿胃大彎切除。胃黏膜用冷生理鹽水沖洗，以消除任何血液污染。用UI評價胃粘膜損傷的程度。

1.6統計分析 潰瘍指數數據使用適馬圖進行擬合。數據通過平均值±標準偏差（SD）（x±s）來表示。雙向t檢驗顯示具有統計學意義。AP值<0.05被認為有統計學意義。使用SPSS 15.0軟件進行了統計分析。

2結果

2.1 BMMSCs移植到損傷的胃粘膜 BMMSCs移植48 h和72 h后，CFDA SE標記的細胞被發現，散落在損傷的大鼠胃黏膜，綠色熒光細胞在損傷的胃粘膜上可觀察 ，但在對照組的胃粘膜中無。這表明， CFDA SE標記的BMMSCs只能移植到損傷的胃粘膜。

2.2 SRY基因的原位雜交技術 雄性大鼠SRY基因可以在有BMMSCs移植的雌性大鼠的胃黏膜上通過原位雜交技術檢測到，但不是在有PBS注射的。在陽性對照組，SRY基因在雄性大鼠胃黏膜中被檢測到。

2.3胃黏膜的動力學變化 BMMSCs移植24 h，48 h和72 h后，分析潰瘍指數。24 h或48 h后BMMSCs移植組和藥物對照組的潰瘍指沒有顯著差異（7.50±2.59）與（8.17±2.64）和（15.50±1.87）與（14.50±1.64）（P>0.05）。然而，在BMMSCs移植72 h后，BMMSCs移植組的平均潰瘍指數為（12.67±2.16），在藥物處理的對照組為（17.33±1.97）（P<0.01）。HE染色胃黏膜觀察病理改變。這些結果表明，移植的BMMSCs可以加速胃潰瘍的愈合。

2.4胃黏膜EGFR和VEGF蛋白的表達 BMMSCs移植24 h，48 h和72 h后，制作胃粘膜組織切片。免疫組化檢測EGFR和VEGF蛋白的表達。與沒有BMMSCs移植的大鼠相比，BMMSCs移植的大鼠體內血管內皮生長因子和表皮生長因子受體蛋白表達顯著升高。

3討論

已經有報告提出，一些成體干細胞的作用可能不只限制于補充局部組織。根據這個假設，血液中循環的骨髓多潛能干細胞，在那里他們可以被招募用于遠程站點的不同組織的再生。作為支持這一假說，據報道，骨髓細胞有助于受損的皮膚，肺，肌肉，腸，腦，肝，心臟和血管內皮細胞的再生。若干研究已經調查了BMMSCs在巴雷特食管，潰瘍性結腸炎，肝臟和胰腺腫瘤的作用。但是很少有研究調查BMMSCs對于損傷的胃黏膜的功能。在這項研究中，我們發現，在大鼠體內移植的BMMSCs在遷移，然后定位在損傷的胃粘膜，加速胃潰瘍的愈合，增加胃黏膜的血管內皮生長因子和表皮生長因子受體蛋白的表達。

編輯/肖慧