戊四唑(Pentylenetetrazole, PTZ)誘導斑馬魚癲癇模型的優化及評價指標

摘要：目的探討建立PTZ誘導斑馬魚癲癇模型的方法，優化PTZ誘導濃度及評價指標。方法在斑馬魚PTZ誘導癲癇模型中，分別對不同濃度PTZ（1.25、2.5、5、10、20、30 mM）、不同的觀察指標（快速運動距離、中速運動距離、慢速運動距離、總的運動距離）進行分析。結果PTZ在10 mM濃度下快速運動距離（V>20 mm/sec）與溶劑組相比，差異顯著（P<0.01），誘導效率最佳。因此，本模型選擇PTZ 10 mM作為誘導濃度，快速運動距離（V>20 mm/sec）的改變作為藥效評價指標。結論斑馬魚PTZ誘導癲癇模型中， 10 mM PTZ為最佳誘導濃度，快速運動距離的改變為最佳的藥效評價指標。

關鍵詞：戊四唑；斑馬魚；癲癇；藥學評價戊四唑（Pentylenetetrazole， PTZ）是γ-氨基丁酸（簡稱GABA）抑制劑，GABA是一種天然存在的非蛋白質氨基酸，是哺乳動物中樞神經系統中重要的抑制性神經物質[1，2]。研究表明，大劑量的PTZ可誘導癲癇發作，是哺乳動物癲癇模型中的常用誘導劑[3，4]。最近，采用PTZ誘導斑馬魚癲癇模型的成功建立，為天然藥物的藥學評價和藥物篩選創造了更為有力的條件[5，6]。但斑馬魚癲癇模型的優化及評價指標存在很多的爭議[5]。 本實驗探討建立PTZ誘導斑馬魚癲癇模型的方法，優化PTZ誘導濃度及藥學評價指標，為高通量的天然藥物篩選提供更為有力的實驗證據。

1資料與方法

1.1一般資料斑馬魚胚胎的繁殖以自然成對交配的方式進行。每次交配準備4~5對成年斑馬魚，平均每對能產200~300個胚胎。在受精后6h（即6 hpf）和24 hpf 對胚胎進行清理（移除已死亡胚胎），并根據胚胎的發育階段挑選合適的胚胎。解剖顯微鏡（SMZ645，Nikon公司）；48/96孔板（Nest Biotech）；行為分析儀（V3，ViewPoint Life Sciences公司）；二甲基亞砜（DMSO，阿拉丁，批號1095515）；戊四唑（Pentylenetetrazole，PTZ）購自美國sigma公司，批號069K1245。

1.2方法在 28 ℃ 條件下用養魚用水孵育胚胎（養魚用水水質：每1L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導率為 480~510 μS/cm；pH 為 6.9~7.2；硬度為 53.7~71.6 mg/L CaCO3）。 在斑馬魚PTZ誘導癲癇模型中，分別對不同濃度PTZ（1.25、2.5、5、10、20、30 mM）誘導斑馬魚癲癇?？瞻讓φ战M為0.1% DMSO，所有實驗組均含有相同濃度的溶劑。每個實驗組均處理8尾斑馬魚。加入藥物后，利用運動/行為分析儀記錄60 min內斑馬魚快速運動距離（V>20 mm/sec）、中速運動距離（4

1.3數據分析與統計學處理實驗數據均用Mean±SE表示。用方差分析和Dunnett's T-檢驗進行統計學分析，P<0.05表明具有顯著性差異。

2結果

2.1 PTZ誘導斑馬魚癲癇模型的建立和優化以48孔板第一板摸索PTZ誘導濃度為例，分別統計分析斑馬魚不同運動速度下的運動距離，見表1。結果顯示：與溶劑組相比，PTZ在5、10 mM濃度下快速運動距離顯著增加（P<0.05，P<0.01）；而PTZ各濃度組在中速運動距離、慢速運動距離及總的運動距離各指標均無顯著性差異。因此，此模型中評價指標選擇快速運動距離進行統計分析，此模型中的快速運動相當于哺乳動物陣攣發作狀態。

2.2 PTZ誘導斑馬魚癲癇模型中最佳濃度確定在48孔板實驗中，PTZ在5、10、20 mM濃度下，誘導組的快速運動距離較溶劑組相比，均顯著增加（P< 0.05）。2次實驗中10 mM濃度PTZ均表現出較好的誘導效率。PTZ在30 mM濃度下，其快速運動距離較溶劑組相比，無統計學差異，較20 mM濃度相比，其快速運動距離反而降低，可能與PTZ引起斑馬魚神經毒性有關，見圖1~4。在96孔板實驗中，PTZ在2.5、5、10、20 mM濃度下，誘導組的快速運動距離較溶劑組相比，均顯著增加（P<0.01），其中10 mM濃度下，快速運動距離增加最大；PTZ在30 mM濃度下，其快速運動距離較溶劑組相比，無統計學差異，結果與48孔板中實驗結果一致，見圖5-6。

3討論

藥理學和毒理學評價是新藥臨床前安全性評價不可分割的一部分。隨著創新藥物開發成本的不斷升高，降低藥物開發過程中的損耗率日益得到關注。近年來，斑馬魚作為整體動物篩選平臺已成為一種在國際上受廣泛關注的全新技術。這項技術的最大優點是在篩選時可以對藥物的效果和對動物的毒性一目了然。而且，如果采用斑馬魚動物模型，利用它生長周期短和獲得ADME/T信息多的特點，可以大大加快篩選化合物的速度，從而降低成本，顯著減少新藥研發的成本。

早期的研究表明，通過觀察浸浴于盛有藥液的96孔平板的小孔內的斑馬魚，可研究藥物對運動行為的不良影響。利用這種方法已經觀察到了常用鎮靜劑如地西泮、褪黑激素對斑馬魚的鎮靜作用，以及興奮劑咖啡因對斑馬魚的興奮作用[7]。將斑馬魚暴露于常用的驚厥劑中，可引發斑馬魚產生驚厥。這一系統也用來檢測新化合物的致驚厥作用[8]。但斑馬魚癲癇模型的優化及評價指標存在很多的爭議[5]。 本實驗在斑馬魚PTZ誘導癲癇模型中，分別對不同濃度PTZ（1.25、2.5、5、10、20、30 mM）、不同的觀察指標（快速運動距離、中速運動距離、慢速運動距離、總的運動距離）進行了分析。結果表明，PTZ在10 mM濃度下快速運動距離（V>20 mm/sec）與溶劑組相比，差異顯著（P< 0.01），誘導效率最佳。因此，本模型選擇PTZ 10 mM作為誘導濃度，快速運動距離（V> 20 mm/sec）的改變作為藥效評價指標。

參考文獻：

[1]Pack， A. M.， Reddy， D. S.， Duncan， S.， et al.Neuroendocrinological aspects of epilepsy: important issues and trends in future research[J]. Epilepsy Behavior，2011，22:94 -102.

[2]Stewart， A. M.， Desmond， D.， Kyzar， E.， et al. Perspectives of zebrafish models of epilepsy: What， how and where next[J]. Brain Research Bulletin，2012，87:135 -143.

[3]L?scher， W.Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs[J]. Seizure，2011，20:359 -368.

[4]L?scher， W.， Schmidt， D. Modern antiepileptic drug development has failed to deliver: ways out of the current dilemma[J]. Epilepsia，2011，52:657 -678.

[5]Afrikanova， T.， Serruys， A. S.， Buenafe， O. E.， et al.Validation of the zebrafish pentylenetetrazol seizure model: locomotor versus electrographic responses to antiepileptic drugs[J]. PLos one，2013，8:1 -9.

[6]Ellis， L. D.， Soanes， K. H.A larval zebra?sh model of bipolar disorder as a screening platform for neuro-therapeutics[J]. Behavioral Brain Research，2012，233， 450 -457.

[7]Lee， G. H.， Sung， S. Y.， Chang， W. N.， et al. Zebrafish larvae exposed to ginkgotoxin exhibit seizure-like behavior that is relieved by pyridoxal-5'-phosphate， GABA and anti-epileptic drugs[J]. Disease Models Mechanisms，2002，5:785 -795.

[8]Eliceiri， B. P.， Gonzalez， A. M.， Baird， A. Zebrafish model of the blood-brain barrier: morphological and permeability studies[J]. Methods in Molecular Biology，2011，686:371 -378.

編輯/申磊