端粒酶催化亞基(hTERT)在膀胱內翻性乳頭狀瘤中表達意義的研究

摘要：目的探討端粒酶催化亞基在膀胱內翻性乳頭狀瘤組織中的表達及意義。方法用RT-PCR 法分別對38例膀胱內翻性乳頭狀瘤組織、53例膀胱低級別移行細胞癌組織、32例正常膀胱粘膜組織進行hTERT檢測。結果膀胱內翻性乳頭狀瘤組織hTERT表達陽性23例（60.5%），膀胱低級別移行細胞癌組織100%陽性表達；32例正常膀胱粘膜組織均無陽性表達。三者比較在統計學上具有顯著性差異（P＜0.01）。結論hTERT 在膀胱內翻性乳頭狀瘤中的高陽性表達可能與其向膀胱癌的惡性轉化有關。

關鍵詞：膀胱癌;膀胱內翻性乳頭狀瘤;端粒酶催化亞基

Study the Expression of Human Telomerase Reverse Transcriptase(hTERT) in the Inverted Papilloma of Bladder

LU Dong-liang1，CUI Shu1 ，JIANG Guo1 ，CHEN Zai-xian2

(1.Department of Urology，The Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College ，Nanchong 637000，Sichuan，China;2.Department of Urology，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China)

Abstract：ObjectiveTo evaluate the significance of detection of human telomerase reverse transcriptase （hTERT）expression in the inverted papilloma of bladder.MethodsUsing reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay，hTERT in 38 inverted papilloma of bladder tissue ，53 TCC tissue and 32 normal bladder tissues were examined.ResultshTERT was detected in 53 of 53 (100%)TCC tissues，23 in 38 （60.5%）the inverted papilloma of bladder and none of 32 normal bladder tissues(0)，the positive rate of hTERT in TCC and in the inverted papilloma of bladder being significantly higher than than in noumal bladder tissues(P＜0.01）.ConclusionThe high expression ofhTERT in the inverted papilloma of bladder maybe have the relelationship toits m alignant transformation.

Key words：Bladder cancer; Inverted papilloma of bladder; Telomerase catalytic subunit膀胱內翻性乳頭瘤(inverted papilloma of thebladder，IPB)是一種以內翻性生長為特征的尿路上皮良性腫瘤，隨著檢測方法的改進和對本病認識程度的提高，發病率逐年上升。由于其存在一定的復發率及惡變率，因此目前臨床上對于膀胱內翻性乳頭狀瘤術后是否定期行膀胱灌注化療以及是否需要長期隨訪膀胱鏡產生了不同的意見，本研究對38例膀胱內翻性乳頭狀瘤、53例膀胱低級別移行細胞癌組織、32例正常膀胱組織進行端粒酶催化亞基檢測及分析，以期探討膀胱內翻性乳頭狀瘤與低級別膀胱移行細胞癌的關系，為臨床提供診治依據。

1資料與方法

1.1一般資料經臨床和病理證實為膀胱內翻性乳頭狀瘤者例38 ，男32例，女6例，年齡31~72歲；膀胱低級別移行細胞癌者53例，男36例，女17例，年齡 29~82歲。正常膀胱粘膜組織32例作為對照組，男16例，女16例，年齡30~83歲。手術時或膀胱鏡檢查時獲取的標本均立即置入液氮罐保存。

1.2試劑及儀器TRIzol 總RNA提取液為美國INVITROGEN公司產品；逆轉錄試劑盒及DNA聚合酶為立陶宛MBI公司產品；凝膠電泳成像系統為美國Bio-Rad GelDoc凝膠電泳成像分析系統；聚合酶鏈反應（PCR）儀為美國ABI公司產品。引物設計參照文獻，引物由北京三博遠志合成，hTERT mRNA 上游引物5'-CGC AAG AGT GTC TGG AGC AA- 3'；下游引物5' -GGA TGA AGC GGA GTC TGG A-3'，擴增片段為145bp。均采用β-肌動蛋白作為內參，內參引物序列上游5'-AAC TCC ATC ATG AAG TGT GA-3';下游5'-ACT CCT GCT TGC TGA TCC AC -3'，擴增片段為247bp。

1.3 方法①TRIzol總RNA提取按照試劑說明書操作。②逆轉錄反映按試劑說明書操作。③PCR反應，25μL反應總體積，取cDNA 2μL，加10×PCR 緩沖液2.5μL，25mol/L的MgCL2 1.5μL，10mmol/L dNTP 0.5 μL，5U/μL DNA 聚合酶0.2 μL，hTRT mRNA 及β-actin mRNA 上、下游引物各0.5μL，滅菌水16.3μL。反應條件為95℃ 5min 預變性；95℃ 45 s，55℃ 45s ，72℃ 1 min ，40個循環；72℃延伸 2 min。④PCR 產物鑒定，取PCR產物5μL進行瓊脂糖電泳，紫外透視儀上觀察結果，并在凝膠成像儀上照相和測定分析。

1.4統計學方法采用SPSS12.0軟件進行統計學處理并進行χ2檢驗。

2結果

38例膀胱內翻性乳頭狀瘤標本中hTERT陽性表達23 例，陽性率為60.5 %； 53例膀胱低級別移行細胞癌組織100%陽性表達；32 例正常膀胱粘膜組織均無陽性表達。結果見表1，三組差異有極顯著性意義P＜0.01。

3討論

端粒酶活性與人類細胞的永生化和癌變密切相關，是最普遍而又最重要的腫瘤特異性的生物學標志之一。端粒酶催化亞基hTERT與端粒酶活性調節的關系最密切，是端粒酶活化過程中的限制性因素，并與端粒酶活性呈現一致性，即在正常體細胞不表達或很少表達，而在惡性腫瘤細胞中呈高度陽性表達。因其在腫瘤中表達的特異性，有研究表明其可作為腫瘤檢測的標志物，在某些腫瘤組織中hTERT 還可以作為生物標記用于鑒定組織惡化的程度，判定其療效和預后[1]。

膀胱內翻性乳頭瘤的生物學特征，因其局限性生長，最多侵犯粘膜固有層，不侵犯肌層，鏡下表現細胞大小一致，異型性不大，核分裂象少見，這些都支持內翻性乳頭瘤的良性特征，故膀胱內翻性乳頭瘤被普遍認為是良性腫瘤，復發及惡變率低。Kyirakos等[2]報道3％ ～7％ 可轉化為膀胱移行細胞癌，約10％可同時伴有膀胱移行細胞癌，并發現 發現有些內翻性乳頭狀瘤病灶中，有約10％ 的表淺病灶由低惡性度移行細胞癌細胞構成，提示內翻性乳頭狀瘤與膀胱癌有著某種程度的關聯。Urakami等[3]對膀胱內翻性乳頭瘤生物學特性進行了研究并與淺表性和浸潤性膀胱移行細胞癌進行比較，發現膀胱內翻性乳頭瘤增殖細胞核抗原(PCNA)及抑癌基因p53的免疫反應顯著低于浸潤性膀胱移行細胞癌，但與淺表膀胱移行細胞癌無明顯差別，表明內翻性乳頭瘤有較高的細胞增殖活性。Monge等[4]認為應將膀胱內翻性乳頭狀瘤定為癌前病變，有少數學者認為應將內翻性乳頭瘤當作早期低級別膀胱移行細胞癌對待。因此，目前臨床上對于膀胱內翻性乳頭狀瘤術后是否定期行膀胱灌注化療以及是否需要長期隨訪膀胱鏡產生了不同的意見，Sung等[5]認為本病雖有一定的復發率，但膀胱內翻乳頭狀瘤畢竟是一種良性病變，根據嚴格標準確診后，并沒有必要像膀胱癌那樣嚴格的術后化療及繁瑣的術后膀胱鏡隨訪。Ho等[6]也提出單純膀胱內翻乳頭狀瘤不伴有移行細胞癌時，無需嚴格的長期復查膀胱鏡。Tiwari等[7]通過對24例病理確診為膀胱內翻性乳頭狀瘤患者的跟蹤隨訪發現，在2年半的隨訪時間里，未見任何腫瘤復發，因此他們認為經尿道腫瘤切除可以達到滿意的效果，沒有必要按照膀胱移行細胞癌進行嚴格的術后灌注及隨訪。Riesz 等[8]通過對30例膀胱內翻性乳頭狀瘤患者隨訪發現，有3例患者分別在術后17、60、90個月惡化為膀胱移行上皮癌。其惡化率為10%，他們認為不能將膀胱內翻性乳頭狀瘤看做為良性腫瘤，而應看作為早期低級別移行細胞癌。因此，膀胱內翻性乳頭瘤的生物學惡性潛能成為非常重要的臨床問題。

本研究通過采用RT-PCR法檢測膀胱內翻性乳頭狀瘤、膀胱低級別移行細胞癌以及正常膀胱粘膜中的hTERT的表達，探討膀胱內翻性乳頭狀瘤與低級別膀胱移行細胞癌的關系。結果顯示，38例膀胱內翻性乳頭狀瘤組織中hTERT陽性表達23 例，陽性表達率為60.5 %，53例膀胱低級別移行細胞癌組織hTERT陽性表達率為100%，正常膀胱粘膜組織32例均無陽性表達。三者之間具有顯著性差異（P＜0.01)，因此我們推測hTERT在膀胱內翻性乳頭狀瘤中的高陽性表達可能與其向膀胱移行細胞癌的惡性轉化有關，我們認為， 膀胱內翻性乳頭狀瘤雖然為良性腫瘤，但由于其存在惡變傾向，我們建議術后應進行規律膀胱灌注化療藥物及嚴格膀胱鏡隨訪。

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