安徽產山銀花HPLC指紋圖譜初步研究

摘要：目的 建立安徽不同產地金銀花HPLC色譜指紋圖譜。方法 以超聲法制備供試液，采用高效液相色譜法，甲醇和0.05%磷酸為流動相，紫外檢測波長327nm，柱溫30℃，流速：0.8 ml/min。結果 分析了10個批號不同產地的山銀花藥材，確定了4個共有峰，可作為其指紋特征。結論 所建立的圖譜具有穩定、重現的特點，為全面控制安徽不同產地山銀花的質量提供了依據。

關鍵詞：山銀花；指紋圖譜；HPLC

為全面評估本地區山銀花及其提取物有效成分的變化及差異，以及進一步探討其內在規律和控制質量，實驗采用HPLC法建立了安徽不同產區采集的山銀花及其提取物的指紋圖譜。本研究采用高效液相色譜法建立了不同產地山銀花藥材的HPLC指紋圖譜分析方法。并對不同產地山銀花藥材指紋圖譜進行比較歸納，以便比較完整地反映山銀花的內在化學信息，并運用\"中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版\"（國家藥典委員會）進行相似度分析。以達到符合國家藥典委員會頒布的《中藥注射劑色譜指紋圖譜實驗研究技術指南（試行）》中相關規定[1]。為山銀花藥材鑒別和質量評價提供了依據，同時也為山銀花在治療人類疾病中發揮其安全性，穩定性和可控性提供科學的依據。

1資料與方法

1.1樣品安徽產山銀花10批，編號S1～S10，經南京中醫藥大學劉圣金博士鑒定，各樣品均符合2010年版《中國藥典》的規定。

1.2對照品綠原酸對照品（chlorogenic acid，純度=98%，購自中國食品藥品檢定研究院，批號0751-201011）。

1.3試劑磷酸（分析純）；甲醇（分析純）；甲醇（色譜純）；超純水（用前需通過溶劑過濾器過濾，超聲脫氣后使用）。

1.4儀器Waters 2695（separation Module）+waters 2487（檢測儀）；色譜柱（Waters Bridge C18 5μm，4.6×150mm column）；溶劑過濾器；科生牌超聲清洗機（KS-120EI；功率120W；40KHZ）；循環水式多用真空泵（SHB-III；180W；50KHZ，鄭州長城工貿有限公司）。

2方法與結果

2.1色譜條件查閱參考資料[2]，并通過預實驗確定測定綠原酸含量的色譜條件，色譜柱：采用waters Bridge C18柱（5μm，4.6mm×150mm）；流動相：甲醇-0.05%磷酸（體積比12：88）；流速：0.8 ml/min；檢測波長：327nm；柱溫：30℃；進樣量：10μl。

2.2對照品溶液的制備精密稱取綠原酸對照品約4.000mg～10mL棕色量瓶內，用50%甲醇（色譜純）溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得質量濃度為0.4mg/ml的對照品溶液，即得。

2.3供試品溶液的制備取山銀花樣品于50℃過夜烘干，粉碎后過65目篩（四號篩）備用。稱取備用山銀花粉末約1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇溶液50mL，超聲處理1h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取5ml續濾液，置25ml棕色量瓶中，加50%甲醇定容得供試品溶液。

2.4方法學考察

2.4.1精密度實驗 取同一批次供試品（1號樣品），連續進樣5次，考察色譜峰相似度的一致性，用\"中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版\"（國家藥典委員會）計算，結果相似度大于0.9，表明儀器精密度良好。

2.4.2穩定性實驗 取同一批次供試品（1號樣品），分別在0、2、4、8、12、18、24h不同時間點進行檢測，用\"中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版\"（國家藥典委員會）計算，結果相似度大于0.9，表明儀供試品溶液在24h內穩定。

2.4.3重復性試驗 取同一批次樣品（1號樣品），按上法分別制備5份供試品，平行測定，考察色譜峰相似度的一致性，用\"中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版\"（國家藥典委員會）計算，結果相似度大于0.9，表明實驗重復性良好。

2.5指紋圖譜的建立按上述方法測定10批樣品的指紋圖譜，分析確定10批樣品共標出4個共有指紋峰（見圖1），其保留時間（min）（見表1）。其中3號峰為綠原酸峰，其峰面積較大，且較穩定，故選擇其為參照峰，計算其它3個共有峰相對保留時間依次為：0.125（1）、0.430（2）、1.134（4）。

2.6指紋圖譜相似度計算將l0批樣品的指紋圖譜導入\"中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版\"（國家藥典委員會）設置參照譜、匹配譜峰、生成對照圖譜和相似度計算，得出各樣品HPLC圖之間和生成的對照樣本圖譜R的相似度。

3討論

提取方法的選擇：超聲提取法操作簡便、節約時間，故采用超聲法。本實驗只考察提取溶媒（不同濃度甲醇以及不同濃度乙醇、溶劑體積）及提取時間對提取效果的影響。結果以50ml 50%甲醇超聲提取1h的含量最高，雜質峰較少。

色譜條件優化：分別考察了乙腈-0.4%磷酸溶液、乙腈-甲醇-0.05%磷酸、甲醇-0.05%磷酸、甲醇-0.05%磷酸、甲醇-0.05%磷酸，從色譜峰峰形、峰信息、出峰時間、分離度、保留時間等因素綜合考慮，確定流動相為甲醇-0.05%磷酸（12：88）。

4結論

本實驗只測定了10批山銀花的指紋圖譜，在此基礎上建立的山銀花對照指紋圖譜，有待進一步用更多批次的山銀花進行驗證，以獲得更為豐富的指紋圖譜信息，使其對山銀花質量的判定更為準確和科學。

參考文獻：

[1]國家藥品監督管理局.中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）[J].中成藥，2000，22（10）：671.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：204-205.

編輯/許言