p21基因啟動(dòng)子甲基化對(duì)血管平滑肌細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

摘要：目的 觀察氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）對(duì)血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）p21基因啟動(dòng)子甲基化及對(duì)VSMC向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。方法 采用組織貼塊法培養(yǎng)人臍血管平滑肌細(xì)胞，給予不同濃度氧化低密度脂蛋白o(hù)x-LDL（0，10mg/L，20mg/L，40mg/L）孵育24h，甲基化特異PCR（MS-PCR）檢測(cè)p21基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化程度，MTT比色法測(cè)定VSMC增殖活性，油紅O染色鏡下觀察計(jì)數(shù)泡沫細(xì)胞比率。結(jié)果 ox-LDL呈濃度依賴性促進(jìn)p21啟動(dòng)子甲基化，同時(shí)平滑細(xì)胞增殖活性增高，向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化增加。結(jié)論 ox-LDL 可以通過(guò)p21基因甲基化促進(jìn)VSMC向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化，p21基因甲基化可能在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生中起到一定作用。

關(guān)鍵詞：p21基因；甲基化；動(dòng)脈粥樣硬化

動(dòng)脈中膜血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）發(fā)生增殖和遷移并轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化（AS）形成過(guò)程中的核心事件。細(xì)胞周期是各種因素刺激細(xì)胞增殖的最后信號(hào)通路，p21是體內(nèi)最重要的細(xì)胞周期蛋白，可與幾乎每一個(gè)Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合并使其失活，從而阻礙細(xì)胞進(jìn)入增殖期。p21等在高膽固醇等促AS因子作用下表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移， 但在此過(guò)程中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)p21基因的突變，從而使傳統(tǒng)遺傳學(xué)理論對(duì)此無(wú)法解釋。表觀遺傳學(xué)理論，尤其是DNA甲基化為解決AS等多基因遺傳疾病提供了新的思路。DNA甲基化不改變基因編碼序列，但啟動(dòng)子區(qū)高甲基化將導(dǎo)致基因表達(dá)抑制和基因沉默。本課題觀察p21基因甲基化對(duì)泡沫細(xì)胞形成的影響，為闡明AS發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料 Gp Genome DNA修飾試劑盒購(gòu)自Chmicon，PCR試劑盒購(gòu)自賽百盛公司，四甲基偶氮唑鹽和二甲基壓砜購(gòu)自Sigma公司，細(xì)胞培養(yǎng)基、小牛血清等購(gòu)自Gibico。常規(guī)化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2方法

1.2.1人血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)：無(wú)菌取剖宮產(chǎn)胎兒臍動(dòng)脈，剝?nèi)≈心ぐ促N塊法培養(yǎng)VSMC，取第3-5代用于實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)前以無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12h使細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。在無(wú)血清培養(yǎng)液中加入0.2%牛血清白蛋白，然后加入不同濃度OX-LDL刺激24h，未加刺激同時(shí)孵育24h細(xì)胞作為對(duì)照。

1.2.2氧化低密度脂蛋白的制備（ox-LDL）：采用非連續(xù)性密度梯度超速離心法分離提取LDL。新鮮人不抗凝血低速離心分離血清，用溴化鉀調(diào)節(jié)密度至1.3g/ml，4°C 50000r/min離心5h，收集LDL，PBS透析，超濾除菌后4°C保存。Lowry法定氮，采用硫酸銅誘導(dǎo)氧化修飾，置于PBS中透析24h后4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 p21 基因甲基化檢測(cè)：采用甲基化特異性PCR法。飽和酚-氯仿法提取樣本DNA，取溶解的DNA樣本1ug，參照Gp Genome DNA修飾試劑盒（Chmicon公司）應(yīng)用亞硫酸鹽修飾，回收后提純行PCR反應(yīng)。p21甲基化特異引物上游序列為5′-TACGCGAGGTTTCGGGATCG-3′，下游序列 5′-AAAAACGACCCGCGCTCG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為133bp；p21非甲基化特異引物上游序列為5′-TATGTGAGGTTTTGGGATTGG-3′，下游序列 5′-AAAAACAACCCACACTCAACC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為133bp。引物由賽百盛生物公司合成。建立50μl反應(yīng)體系，內(nèi)含10×反應(yīng)緩沖5μl ，dNTP1μl，上下游引物各20pmol，Taq酶0.5單位，模板 DNA 5μL，雙蒸水補(bǔ)至50μl，覆蓋石蠟油，940C 5min 后，進(jìn)入940C變性1 min ，670C復(fù)性1 min ，720C延伸1 min的循環(huán)，共35個(gè)循環(huán)，最后720C延伸5 min，產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳分離，拍照后掃描條帶，以同一樣本甲基化條帶與非甲基化條帶之比進(jìn)行甲基化程度半定量。

1.2.4 細(xì)胞增殖活力檢測(cè) MTT比色法。細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌，再加入20μL MTT工作液及200μL培養(yǎng)液，4h后吸去上清，每孔加入二甲基亞砜150μL，充分振蕩使結(jié)晶物融解，490mm波長(zhǎng)在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值，以試驗(yàn)孔OD均值/對(duì)照孔OD均值作為細(xì)胞增殖的相對(duì)活性。

1.2.5 泡沫細(xì)胞的半定量 細(xì)胞油紅\"O\"染色，拍照后利用圖像掃描儀根據(jù)細(xì)胞脂滴的面積進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)。細(xì)胞脂滴的面積小于細(xì)胞核的面積者記為\"-\"，面積等于或大于細(xì)胞核的面積記為\"+\"，即為泡沫細(xì)胞，每一塊玻片計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算泡沫細(xì)胞的陽(yáng)性率

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用x±s表示，計(jì)數(shù)資料以百分比（%）表示，所有統(tǒng)計(jì)分析均在SPSS12.0軟件上進(jìn)行。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

動(dòng)脈粥樣硬化是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的血管疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今尚未闡明。血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移受周期依賴激酶（CDK）和細(xì)胞周期蛋白共同作用而完成，尤其是G1期過(guò)渡到S期受周期蛋白依賴激酶抑制因子的調(diào)節(jié)。p21是體內(nèi)最重要的細(xì)胞周期蛋白，可與幾乎每一個(gè)Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合并使其失活，從而阻礙細(xì)胞進(jìn)入S期。在高膽固醇等促AS因子作用下， p21等抑制增殖因子表達(dá)降低，導(dǎo)致SMCs增殖和遷移，成為富含脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞 [4]。

基因的甲基化是表觀遺傳學(xué)上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的一種常見(jiàn)機(jī)制，是最常見(jiàn)的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄后修飾方式，常常導(dǎo)致基因的表達(dá)抑制。DNA甲基化是指在甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)下CpG 二核苷酸中胞嘧啶第5位碳原子加上一甲基基團(tuán)，變成5-甲基胞嘧啶[3]。高度保守的管家基因啟動(dòng)子區(qū)富含CpG 二核苷酸，啟動(dòng)子區(qū)高甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)抑制，使該基因沉默和失活[1]。

研究發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因的甲基化在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。對(duì)同型半胱氨酸（Hcy）的研究提示Hcy濃度升高會(huì)影響體內(nèi)許多物質(zhì)的甲基化過(guò)程，Hcy已被認(rèn)為是獨(dú)立的致AS危險(xiǎn)因子[3，8]。已知AS患者粥樣斑塊中雌激素受體α（ER2α） 基因的甲基化水平顯著增高；體外試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)Hcy可以促進(jìn)VSMCs向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化，同時(shí)伴有ER2α甲基化增加，上述結(jié)果提示ER2α基因表達(dá)沉默與AS 形成間存在相關(guān)性[8，10]。對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化兔頸動(dòng)脈斑塊p53基因檢測(cè)提示其甲基化程度明顯增高。

VSMCs的增殖和遷移是動(dòng)脈粥樣硬化的主要病理特征之一，本研究結(jié)果表明ox-LDL可以通過(guò)影響DNA的甲基化修飾引起p21高甲基化，這可能是其促VSMCs增殖進(jìn)而引起動(dòng)脈粥樣硬化的重要機(jī)制。

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編輯/王海靜