人線粒體融合蛋白—2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

摘要：目的 構(gòu)建人線粒體融合蛋白-2 （mitofusin-2， MFN2）基因真核表達(dá)載體并對(duì)其進(jìn)行鑒定。方法 在pEGFP-N1載體多克隆位點(diǎn)插入人MFN2基因編碼區(qū)序列，酶切、測序驗(yàn)證是否插入及正確性。將所構(gòu)建載體轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的人血管平滑肌細(xì)胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs），熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)；熒光定量PCR和Western blot分別檢測MFN2 的mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果 成功構(gòu)建了人MFN2 基因真核表達(dá)載體，其轉(zhuǎn)染VSMCs后，可以檢測到MFN2 mRNA及蛋白水平高表達(dá)（P<0.01）。結(jié)論 成功構(gòu)建了人MFN2基因真核表達(dá)載體，且能夠在原代VSMC中過表達(dá)。

關(guān)鍵詞：線粒體融合蛋白-2；載體構(gòu)建；鑒定

血管平滑肌細(xì)胞（Vascular smooth muscle cells， VSMCs）的增殖是動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis， AS）形成的中心環(huán)節(jié)。線粒體融合蛋白-2 （mitofusin-2， MFN2）是一種細(xì)胞增殖抑制因子，能抑制VSMCs增殖[1，2]。本研究擬通過構(gòu)建人MFN2基因真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染原代人臍靜脈平滑肌細(xì)胞，熒光定量PCR法及Western blot檢測MFN2 mRNA及蛋白表達(dá)，為今后研究MFN2在AS中的作用打下良好基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1一般資料 原代人臍靜脈平滑肌細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自Hyclone公司；大腸桿菌感受態(tài)DH5α購自北京博邁德生物科技公司；真核基因表達(dá)載體pEGFP-N1購自 Clontech公司；Taq DNA 聚合酶購自寶生物公司；限制性內(nèi)切酶Bgl II及EcoR I、T4 DNA連接酶均購自Fermentas 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自Fermentas公司；TRIzol試劑、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；兔抗人MFN2抗體購自北京博奧森生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1原代細(xì)胞人臍靜脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 采用于海嬌[3]等方法培養(yǎng)及鑒定原代培養(yǎng)的人臍靜脈平滑肌細(xì)胞。

1.2.2人MFN2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建 在NCBI網(wǎng)站查找人 MFN2 mRNA編碼區(qū)序列，并設(shè)計(jì)引物。上游引物：5'-GAAGATCTATGTCCCTGC TCTT CTCTCGAT-3'；下游引物：5'-GGAATTCTCTGCTG GGCTGCAGGTACT-3'，上下游引物分別引入BglII及EcoR I酶切位點(diǎn)（以下劃線標(biāo)出）。TRIzol法提取人臍靜脈平滑肌細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；膠回收進(jìn)行酶切-連接后轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，提取質(zhì)粒經(jīng)BglII及EcoR I雙酶切及測序鑒定。測序正確者命名為pEGFP-MFN2。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合60%～80%時(shí)，設(shè)置pEGFP-N1空質(zhì)粒對(duì)照組及pEGFP-MFN2轉(zhuǎn)染組，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔。按照Lipofectamine 2000說明書步驟進(jìn)行，轉(zhuǎn)染各組后37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，6h后更換完全培養(yǎng)液。48h后用熒光顯微鏡觀測各組細(xì)胞綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)情況。

1.2.4熒光定量PCR檢測MFN2 mRNA的表達(dá) 提取轉(zhuǎn)染pEGFP-MFN2細(xì)胞的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行熒光定量PCR。以GAPDH為內(nèi)參照，根據(jù)PCR儀自動(dòng)生成的Ct值，根據(jù)公式：目的基因的相對(duì)量=2-△△Ct計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 western blot檢測MFN2 蛋白的表達(dá) 按照全蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h， 分別用抗MFN2和抗β-actin抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜；辣根過氧化物酶（1：3000）室溫標(biāo)記1 h，TBST洗膜；X光膠片曝光、顯影、定影。照像并分析，以β-actin 蛋白為內(nèi)參，用MFN2與β-actin條帶像素灰度的比值表示MFN2 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果以 表示，應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩樣本間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

MFN2 是近年發(fā)現(xiàn)的具有許多生物學(xué)功能的蛋白，在VSMCs以及心、腎等組織中廣泛分布[4]。研究發(fā)現(xiàn)，高血壓大鼠、球囊損傷大鼠和ApoE基因敲除小鼠的VSMCs中Mfn2表達(dá)均明顯下調(diào)。我國學(xué)者陳光慧等[1]首次發(fā)現(xiàn)MFN2基因控制VSMCs增殖，其機(jī)制主要在于MFN2是原癌基因Ras的直接負(fù)調(diào)控因子，能夠與其相互作用，阻滯Ras-Raf-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而將細(xì)胞周期阻斷在G0/G1期。研究還發(fā)現(xiàn)，血管緊張素II、內(nèi)皮素-1及IL-1等可以通過下調(diào)MFN2表達(dá)，促進(jìn)VSMCs的增殖，而相應(yīng)的受體阻斷劑可以阻斷該作用；MFN2的表達(dá)水平可受到心鈉素和腎上腺髓質(zhì)素的正調(diào)節(jié)，從而抑制VSMCs的增殖[4]。為了進(jìn)一步明確MFN2的作用，我們初步構(gòu)建了含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）報(bào)告基因的人MFN2真核重組表達(dá)載體。結(jié)果表明成功構(gòu)建了人MFN2 基因真核表達(dá)載體，并且將其其轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的VSMCs，利用熒光定量PCR及Western blot可以檢測到MFN2 mRNA及蛋白水平高表達(dá)，說明載體構(gòu)建成功而且成功表達(dá)于原代VSMCs，將為今后深入研究MFN2的功能及在AS中的作用奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]CHEN K H，GUO X，MA D，et al.Deregulation of HSG triggers vascular proliferative disorders[J].Nat Cell Biol，2004，6（9）：872-883.

[2]Gerhard M， RoddyM A， Greager SJ， et al. Ageing progressively impairs endothelium-dependent vasodilation in forearm resistance vessels of human[J].Human， 1996， 27（4）：849-853.

[3]于海嬌，馬琳娜，徐支芳，等.同型半胱氨酸對(duì)血管平滑肌細(xì)胞周期及P27和CyclinA表達(dá)的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2011，21（36）：4487-4492.

[4]Chien KR，Hoshijima M. Unraveling ras signals in cardiovascular disease[J].Nature Cell Biology 2004，6：807-808.

編輯/孫杰