常用因子類輔料對蛋白含量檢測LOWRY法的影響

摘要：目的 探索因子類輔料對蛋白含量檢測的影響。方法 將不同含量的因子類輔料添加至人凝血因子Ⅷ樣品中，采用中國藥典三部中的蛋白含量檢測方法（LOWRY法）檢測添加輔料與未添加輔料的人凝血因子Ⅷ原液的蛋白含量，同時與凱氏定氮法進行比較，計算輔料的干擾率，以評價其干擾的大小。結果 常用因子類輔料（甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、甘露醇）在因子類產品中對蛋白含量的干擾率，賴氨酸干擾最小，其次為甘氨酸，干擾最大的是精氨酸和甘露醇。結論 采用LOWRY法顯示這4種常用因子類輔料對蛋白含量的干擾并不強烈，但LOWRY法準確快速，操作簡單，所以建議在生產過程控制中采用LOWRY法進行蛋白含量的快速檢測。

關鍵詞：常用因子類輔料；人凝血因子Ⅷ；LOWRY法

隨著國內因子類產品的純度越來越高，隨之而來的問題是高純因子類產品的蛋白含量很低（0.1～2mg/ml），輔料含量卻很高。中國藥典三部中的第一種蛋白含量檢測方法采用凱氏定氮法，但是此法對于低于0.5mg/ml含量蛋白檢測的樣品檢測穩定性較差，而且操作繁瑣，耗時較長。為解決此問題，本次研究采用靈敏度高、反應迅速的LOWRY法[1]對因子類產品的蛋白含量檢測進行探索，同時采用凱氏定氮法進行對比，觀察常用輔料對因子類產品蛋白含量的影響，以期建立因子類產品蛋白含量的快速檢測方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 島津UV-1800紫外-可見分光光度計，BUCHI K-360型蒸餾系統，BUCHI K-439型消化系統，Metrohm877型滴定儀，甘氨酸（天津天安）、賴氨酸（上海味之素）、精氨酸（上海味之素）、甘露醇（北京雙鶴），硼酸（成都科龍），硫酸（成都金山），氫氧化鈉（成都科龍），鎢酸鈉（成都科龍）LOWRY法試劑盒（美國BIO-RAD），人凝血因子Ⅷ原液-取自生產過程中，人凝血因子Ⅷ（凱氏定氮法）質控品

1.2方法 LOWRY法本法用于微量蛋白質的含量測定。蛋白質在堿性溶液中可形成銅-蛋白復合物，此復合物加入酚試劑后，產生藍色化合物，該藍色化合物在波長650nm處的吸光度與蛋白質的含量成正比，根據供試品的吸光度，計算供試品的蛋白質含量[2]。

凱氏定氮法：本法是分析化學中一種常用的確定有機化合物中氮含量的檢測方法，根據含氮有機物加濃硫酸經消化后，生成硫酸銨，硫酸銨倍氫氧化鈉分解釋放出氨，氨被水蒸氣蒸餾入硼酸液中生成硼酸銨，最后用強酸滴定，依據強酸消耗量可計算出供試品的含氮量，再乘以6.25得到蛋白含量。

1.3輔料配方 由于不同廠家添加的輔料不同，因此我們主要考察4種主流輔料（甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、甘露醇[3]）的干擾情況，同時以人凝血因子Ⅷ原液的輔料添加量為例，考慮輔料作為保護劑的最大量（見表1）。通過比較含輔料與不含輔料的蛋白含量的檢測結果評價其干擾性。

1.4 LOWRY法標準曲線設計 將標準品（試劑盒自帶）分別稀釋為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/ml；制作標準曲線，計算直線回歸相關系數。

1.5樣品檢測 本文采用LOWRY法和凱氏定氮法檢測兩種蛋白濃度溶液的蛋白含量。按照表1中的配方濃度用純化水配制成輔料溶液，分別用純化水和各輔料溶液將人凝血因子Ⅷ原液稀釋至1.0 mg/ml 和0.2 mg/ml，將2種濃度的樣品用LOWRY法試劑盒（BIO-RID試劑）測定3次，用紫外可見分光光度計在650nm處進行OD值測定，并將樣品的OD值代入標準曲線中進行線性回歸，求得樣品的測定值。同時用凱氏定氮法進行對比。

2 結果

2.1標準品的相關性試驗結果，試驗3次，其相關系數（R2）分別為0.9993、0.9993、0.9990。說明該方法具有很好的線性相關性，即用該標準品作為標準曲線，所求的回歸方程是有意義的。

2.2使用輔料和純化水作為稀釋液稀釋人凝血因子Ⅷ原液至1.0mg/ml和0.2 mg/ml兩種濃度，采用LOWRY法進行蛋白含量測定，同時比較LOWRY法和凱氏定氮法的RSD值，結果見表2和表3。

3 討論

試驗結果表明，甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、甘露醇4種輔料均對因子類產品的蛋白含量檢測結果有干擾，在1.0mg/ml和0.2mg/ml兩種蛋白濃度時，LOWRY法的檢測結果表明賴氨酸干擾最小，其次為甘氨酸，干擾最大的是精氨酸和甘露醇。凱氏定氮法的結果顯示蛋白含量檢測的重復性較差（1.0mg/ml樣品濃度時最大RSD值為9%，0.2 mg/ml樣品濃度時最大RSD值為22%），且呈現濃度越低重復性越差的趨勢，可能為低蛋白濃度接近了凱氏定氮法的檢測下限，造成數據波動性較大，影響了這種方法的準確性。而LOWRY法的數據重復性較好（1.0mg/ml和0.2mg/ml樣品濃度時最大RSD值均為4%，），且呈現濃度越低干擾率越小的趨勢（1.0mg/ml樣品濃度時甘露醇最大干擾率14.1%，0.2mg/ml樣品濃度時甘露醇最大干擾率9.1%），同時LOWRY法檢測流程較為簡單快速，非常適合微量蛋白濃度的檢測。所以本人建議在生產過程控制中采用LOWRY法進行蛋白含量的快速檢測，以期達到質量控制的目的。

參考文獻：

[1]李海玲，彭書明，李凜，等.4種常用蛋白濃度測定方法的比較[J].中國生物藥化雜志，2008，04：277-278+282.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典三部[M].中國醫藥科技出版社，附錄34蛋白質測定法（LOWRY法），2010.

[3]鄭麗欣.探討甘氨酸、甘露醇對LOWRY法測蛋白含量的干擾[J].海峽藥學，2006，03：81-83.編輯/哈濤