大鼠PDGF—C基因真核表達載體的構建與鑒定

摘要：目的 構建并鑒定大鼠血小板衍生生長因子C（PDGF-C）基因的真核表達載體。方法 根據GenBank數據庫提供的基因序列，設計合成大鼠PDGF-C基因CDS擴增引物，RT-PCR法獲得目的基因，T載體連接測序后，構建pEGFP-N1-PDGF-C真核表達載體，雙酶切鑒定。結果 RT-PCR 擴增大鼠PDGF-C基因片段為1053bp，與預期大小相符；測序結果表明該目的基因序列與GenBank 公布序列一致；構建的重組質粒pEGFP-N1-PDGF-C雙酶切鑒定正確。結論 成功構建了大鼠PDGF-C基因的真核表達載體。

關鍵詞：大鼠；PDGF-C基因；載體構建

Abstract：Objective To construct and identify a eukaryotic expression plasmid of rat PDGF-C gene. Methods An rat PDGF-C gene fragment was amplified and sequenced， then cloned into pEGFP-N1 to construct the eukaryotic expression plasmid pEGFP-N1-PDGF-C. The recombinant plasmid was identified by using double restriction enzyme digestion. Results The RT-PCR product was a gene fragment with 1053bp， and the nucleotide sequence of that was consistent with the sequence of the rat PDGF-C gene registered in GenBank. The recombinant eukaryotic expression plasmid pEGFP-N1-PDGF-C was identified and verified as correct by double restriction enzyme digestion. Conclusion A recombinant eukaryotic plasmid of rat PDGF-C gene was successfully constructed.

Key words： Rat； PDGF-C gene； Vector construction

血小板源生長因子C（Platelet-derived growth factor C，PDGF-C）是近些年發現的PDGF家族新成員，在動脈粥樣硬化、高血壓、纖維化疾病以及腫瘤的發生發展中具有重要意義[1]。設計并構建PDGF-C基因的真核表達載體，為后續相關研究提供研究基礎。

1資料與方法

1.1一般資料 pEGFP-N1真核表達載體由本實驗室保存。限制性內切酶BglII和SalI、T4DNA 連接酶、LA Taq 聚合酶 （帶2×GC Buffer I）、dNTPs、及pMD18-T載體購自TaKaRa公司；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 購自Fermentas公司；Trizol Reagent、DH5α感受態細胞、DNA Marker、DNA回收試劑盒及質粒抽提試劑盒購自天根生物有限公司；引物由上海生工生物有限公司合成；SD大鼠購自寧夏醫科大學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 大鼠PDGF-C基因的克隆與測序 根據已發表大鼠PDGF-C基因序列（GenBank Accession No. NM_031317），應用primer premier 5.0軟件設計合成大鼠PDGF-C基因的CDS擴增引物。上游引物：5'- GAAGATCTATGCTCCTCCTCGGCCTC-3'，下游引物：5'-ACGCGTCGACCCCTTCTGTG TTTCCTCTA CACAC-3'，在上下游引物的5'端分別引入BglII和SalI的酶切位點，并加入保護堿基，由上海生工生物技術有限公司合成。Trizol 試劑提取SD大鼠肝臟組織總mRNA，反轉錄得到cDNA，在LA Taq 酶作用下進行PCR擴增。反應條件：94℃ 5min；94℃ 45s，57℃ 45s，72℃ 50s，循環30次；72℃ 10min。PCR產物膠回收后，連接到pMD18-T載體上（命名為T-PDGF-C），轉化后小量提取該質粒，酶切鑒定后送上海生工生物技術有限公司進行測序。

1.2.2 pEGFP-N1-PDGF-C 重組質粒的構建與鑒定 用內切酶BglII和SalI將pEGFP-N1質粒和測序正確的T-PDGF-C質粒雙酶切，電泳、膠回收目的片段后，用T4 DNA連接酶連接得到pEGFP-N1-PDGF-C重組質粒，轉化和質粒提取后，進行雙酶切鑒定，內切酶為BglII和SalI。

2 結果

2.1 大鼠PDGF-C基因的克隆與測序 以SD大鼠肝臟組織獲得的cDNA為模板進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后可見大小約1053bp的特異性條帶（見圖1）。PCR 產物連入pMD18-T載體進行測序，測序結果經BioXM 2.6軟件分析與GenBank公布的大鼠PDGF-C基因序列完全相同。

2.2 pEGFP-N1-PDGF-C 重組質粒的鑒定 將pEGFP-N1-PDGF-C 重組質粒用BglII和SalI進行雙酶切，結果得到1053bp和4.7kb兩個酶切片段（見圖2），證明大鼠PDGF-C基因重組到了真核表達載體pEGFP-N1中。

3 討論

高血壓、動脈粥樣硬化等血管增殖性疾病嚴重危害著人類的健康，并且其發病率呈逐年遞增的趨勢。血管平滑肌細胞的增殖和遷移是血管增殖性疾病發病的核心環節，其病理學分子機制是近年來血管增殖性疾病的研究熱點，也是目前防治的難點[2]。血小板衍生生長因子（PDGF）是成纖維細胞、平滑肌細胞以及其它間充質來源細胞的強有絲分裂原和化學驅動劑，其過度表達與心血管疾病的發生有密切的關系。

PDGF-C是最近發現的PDGF家族新成員，它在多種正常和病理組織中表達，在血管中，PDGF-C主要表達于平滑肌細胞，提示其可能參與血管增殖性疾病的發病機制。本研究從SD大鼠肝臟組織成功克隆出了PDGF-C基因開放閱讀框序列，其測序結果與GenBank 公布的基因序列（GenBank Accession No. NM_031317）完全相同。將PDGF-C基因克隆入pEGFP-N1真核表達載體后，經雙酶切鑒定，證實該基因重組到了真核表達載體pEGFP-N1中。PDGF-C基因真核表達載體的成功構建，為進一步研究該基因在血管平滑肌細胞增殖過程中的作用，以及血管增生性疾病的分子靶向治療方面提供實驗基礎。

參考文獻：

[1] 唐鵬， 郭喬楠， 蔣軍. PDGF家族新成員-PDGF-C[J]. 現代生物醫學進展， 2007， 7（2）： 301-302.

[2] Majesky MW. Developmental basis of vascular smooth muscle diversity[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2007， 27 （6）： 248-258.編輯/許言