無創產前基因檢測在4168例產前篩查高風險孕婦中的應用

摘要：目的 評估無創產前基因檢測（noninvasive prenatal testing，NIPT）在胎兒染色體非整倍體篩查與診斷中的應用價值。方法 2012年8月～2014年2月在湖南省婦幼保健院產前診斷中心就診的孕早期或中期生化篩查高風險（21-三體風險≥1/270，18-三體風險≥1/350）的4168例孕婦，對其進行NIPT，檢測結果為高風險者進行傳統的胎兒核型分析確認，檢測結果為低風險者隨訪妊娠結局。結果 4168例孕婦中，NIPT高風險59例，有52例做了傳統的胎兒核型分析，21-三體和18-三體符合率100%（32/32），13-三體符合率0（0/1），性染色體異常符合率31.58%（6/19）。4109例低風險孕婦隨訪到4000例，其中B超檢查發現胎兒結構異常13例，引產12例。未發現21或18-三體出生。結論 NIPT對21-三體和18-三體檢測具有較高的敏感性和特異性；作為二線篩查方法用于妊娠早期或妊娠中期篩查陽性病例，可減少98%由于篩查假陽性而造成的不必要的侵入性產前診斷操作。

關鍵詞：無創產前基因檢測；產前篩查；高風險；染色體非整倍體；侵入性產前診斷

我國的出生缺陷總發生率約為5.6%[1]，出生缺陷人口的歷年遞增嚴重影響我國人口的整體素質，不僅給家庭和社會帶來沉重負擔，也成為重大的社會人口問題之一，成為我國一個嚴重的公共衛生問題[2]。染色體病是導致嚴重出生缺陷的重要原因，發生率約為1/160[3]。染色體病無法根治，可通過產前篩查和產前診斷進行預防。常規的生化檢查-核型診斷-臨床引產流程存在耗時長、有創操作等缺陷[4]。易增加孕婦流產概率及心理負擔，同時由于唐氏篩查有較高的假陽性率，多數孕婦進行產前羊水穿刺并非必要。目前廣泛開展的孕婦外周血中胎兒游離DNA大規模平行測序，檢測胎兒非整倍體無創產前基因檢測技術（noninvasive prenatal testing，NIPT）為當前的產前篩查診斷模式提供了新的選擇。本研究針對高齡、唐氏生化篩查高風險孕婦，開展了NIPT檢測，現報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料 2012年8月～2014年2月在湖南省婦幼保健院產前診斷中心就診的孕早期或中期生化篩查高風險（21-三體風險≥1/270，18-三體風險≥1/350）的孕婦，對其進行常規的侵入性產前診斷核型分析方法和胎兒非整倍體無創產前基因檢測技術介紹，經過知情同意、自愿選擇接受無創產前DNA檢測，檢募集4168例。年齡18～46歲，孕12～35 w，B超提示單胎，自然妊娠，無地中海貧血基因攜帶者、孕前3個月無輸血或骨髓移植記錄。

1.2方法 孕婦外周血胎兒DNA的無創基因檢測與北京貝瑞和康生物技術有限公司合作，簽署知情同意書后，選取愿意參與試驗的孕婦4168例，采用Streck管收集外周血10ml，通過兩次離心法從孕婦外周血中分享出血漿，使用商業化試劑盒提取血漿DNA，進行文庫存制備，定量后進行簇生成，在Hiseq 2000測序儀上完成36 bp高通量單端測序。數據分析時首先將測序結果序列與人類標準基因組（hg19）進行比對，最后計算出待檢樣本的Z值，Z值=（待測樣本目標染色體占全基因組的百分比-對照組正常組目標染色體占全基因組百分比平均值）/對照正常組目標染色體占全基因組百分比標準差）。

測序得出的原始序列落在每個染色體上的比值都處在一個固定的范圍內（CV<1%，CV即變異系數=標準差/平均值），通過目標染色體序列占全基因序列比值是否偏離正常樣本標準差便能判讀出胎兒目標染色體是否為3條。

1.2細胞染色體核型分析 無創基因檢測高風險者，15～24 w者在B超引導下行羊膜腔穿刺術抽取羊水20～30 mL，>24 w者在B超引導下抽取臍血0.5～1 mL，進行細胞染色體核型分析。

1.3對于無創基因檢測低風險者，部分患者于妊娠結束時抽取臍帶血，進行細胞染色體核型分析，其余隨訪其胎兒出生后情況。

2結果

2.1無創產前基因檢測結果 檢測的4168例孕婦中，結果顯示為高風險共59例，陽性率為1.42%。其中21-三體高風險為33例，18-三體高風險5例，13-三體高風險1例，性染色體異常高風險20例。

2.2確診結果 以羊水或臍血染色體核型分析的結果為金標準進行結果對照，檢測出的33例21-三體高風險確診29例為21-三體，另4例因未婚或無生育指標等原因拒絕侵入性產前診斷，自行引產，無法確定核型；檢測出的5例18-三體高風險確診3例為18-三體，1例超聲發現多發畸形在外院引產和1例自然流產未確定核型；檢測出的1例13-三體高風險確診正常；檢測出的20例性染色體異常高風險確診6例性染色體異常，1例胎兒畸形，幾乎無羊水平段未確定核型，13例確診正常，見表1。

2.3 NIPT低風險孕婦妊娠結局隨訪結果 4109例低風險孕婦隨訪到4000例，其中B超檢查發現胎兒結構異常13例（先天性心臟病6例、唇腭裂3例、肺囊性腺瘤樣病變1例、多囊性腎發育不良1例、足內翻1例、左腎缺如1例），引產12例。已分娩嬰兒中未發現21或18-三體綜合征出生。

3討論

3.1 NIPT對胎兒染色體非整倍體檢測的臨床價值 胎兒染色體非整倍體的無創DNA產前檢測（noninvasive prenatal testing，NIPT），是利用大規模平行測序技術（massively parallel sequencing，MPS）對母體外周血中的游離DNA進行深度測序，獲取胎兒染色體信息的方法。1997年香港中文大學的盧煜明教授等通過PCR擴增得到母體外周血中Y染色體的特異性DNA序列，從而證明懷有男性胎兒的母血漿中存在胎兒游離DNA（cell free fetal DNA，cffDNA）[5]。新一代測序技術的快速發展和成熟為cffDNA的檢測提供了技術保障，從孕5 w開始，孕婦外周血中即可檢測到胎兒的游離DNA，胎兒游離DNA含量隨孕周增大而增加。目前的研究顯示，NIPT對胎兒21-三體檢測敏感性和特異性較高，對其他染色體非整倍體的檢測目前也有了一些進展[6]。

本研究結果顯示NIPT對21-三體和18-三體檢測的特異性和敏感性均為100%，陽性預測值100%。1例13-三體高風險染色體結果正常，20例性染色體異常高風險染色體結果正常的有13例，提示目前的分析策略對13-三體和性染色體數目異常的識別率尚不理想。Chen等[7]采用非重復掩蓋的人基因組參考序列提高測序短序列的比對匹配數量，并校正GC含量偏倚，這種新分析策略使13-三體識別率從36%提升到100%（25/25）。因此，分析技術的改進，將進一步提升對13-三體和其他染色體數目異常的識別能力，拓展NIPT的應用范圍。本研究中4109例NIPT的低風險未發現21-三體假陰性，陰性預測值達到100%，但樣本量有限，存在2.65%的失訪率，還需更多檢測數據證實。

3.2 NIPT避免了一部分常規產前篩查假陽性孕婦不必要的侵入性產前診斷操作 為了減少染色體病患兒的出生，目前國內推廣對廣大孕婦進行孕早期和孕中期血清學篩查[8]，可以發現染色體異常高危人群；而對高危孕婦進行羊膜腔穿刺等侵入性產前診斷技術行染色體核型分析是產前篩查后續重要的產前診斷方法，為臨床的金標準[9]，但有創取樣有0.5%～2%的流產風險，且容易導致胎膜早破、絨毛羊膜炎、陰道出血、早產等并發癥，而且這種篩查技術本身存在5%以上的假陽性率的問題[10]，導致高危孕婦接受率偏低，即依從性差。傳統的有創產前診斷技術還存在診斷通量低下，專業人員缺乏，人員培訓及實驗室建設周期長，報告時限過長等諸多問題[10]。湖南省婦幼衛生信息監測顯示，2012年，湖南省孕產婦數852982人，共行產前篩查330467人，篩查率38.74%。篩查高危孕婦20553人，有9559人接受產前診斷，高危人群產前診斷率為46.51%，盡管篩查工作的數量遠遠不夠，但就目前的篩查量而言，后續的產前診斷的技術力量已經遠遠達不到要求。大量篩查陽性的病例缺乏后續診斷，失去篩查的意義。

本研究表明NIPT對21-三體和18-三體具有很高的敏感性，把NIPT作為二線篩查方法用于妊娠早期或妊娠中期篩查陽性病例，可減少98%由于篩查假陽性而造成的不必要的侵入性產前診斷操作，同時減少操作相關的不良后果，有效地緩解侵入性產前診斷技術力量不足的現狀。

參考文獻：

[1]中華人民共和國衛生部.中國出生缺陷防治報告（2012）[EB/OL].[2013-08-01].http：//www.gov.cn/gzdt/2012-09/12/content_2223371.htm.

[2]邊旭明，戚慶偉.染色體異常產前篩查和產前診斷工作任重而道遠[J].實用婦科與產科雜志，2010，26（12）：889-890.

[3]Driscoll DA.Gross S Clinical practice Prenatal screening for aneuploidy[J].N Eng J Med.2009，360（24）：2556-2563.

[4]邊旭明，戚慶煒.我國產前細胞遺傳學診斷的現狀與對策[J].中華婦產科雜志，2011.46（9）：641-644.

[5]邊旭明.胎兒染色體非整倍體的無創DNA產前檢測[J].實用婦產科雜志，2013，5（29）：330-333.

[6]宋亦軍，劉俊濤.無創產前檢測技術在胎兒非整倍體產前檢測的應用現狀及前景[J].中華圍產醫學雜志，2013，10：626-631.

[7]Chen E Z，Chiu R W，Sun H，et al.Noninvasive Preantal diagnosis of fetal trisomy 18 and trisomy 13 by maternal plasma DNA sequencing[J].PLoS One，2011，6（7）：e21791.

[8]蔣宇林，邊旭明.唐氏綜合征產前篩查模式的發展[J].中華檢驗醫學雜志，2011，11（34）：1053-1056.

[9]Wang JY，Zheng DK，ZilbersteinME，et al.Non-invasive exclusion of fetal aneupliody in an at-risk couple with a balanced translocation[J].Mol Hum Rep rod，2000，6（2）：103-106.

[10]邊旭明，蔣宇林，戚慶煒.產前診斷，走中國自己的道路[J].中華婦產科雜志，2012，47（11）：801-803.

編輯/肖慧