RT—PCR在我院手足口病檢測中的應用

摘要：目的 探究RT-PCR技術檢測手足口病的準確性，為后期臨床監測提供參考。方法 選取我院門診收入的200例手足口病患兒作為研究對象，隨機選取其腸道、肛門、咽拭子樣本共320例。使用RT-PCR技術對樣本進行定性檢測，觀察檢測結果并進行分析。結果 本研究中檢出EV71陽性病毒105例，CoxA16陽性病毒51例，EV陽性病毒11例。兩種熒光RT-PCR檢測技術結果比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結論 RT-PCR技術應用于臨床檢測手足口病具有重要作用，值得在后期臨床中推廣及使用。

關鍵詞：RT-PCR技術；手足口病；檢測；臨床應用

手足口病（HFMD）是兒童中常見的一種傳染性疾病，屬于我國法定的報告管理型丙類傳染病。該癥的患者常于口、足、手等部位出現皰疹或皮疹，同時伴有不同程度的發熱癥狀，病情嚴重者會導致腦炎、神經源肺水腫、無菌性腦膜炎、心肌炎和急性遲緩麻痹等。手足口病的主要致病病毒是腸道71型病毒（EV71）和柯薩奇病毒中A組16型（CVA16）。部分患者在感染手足口病病毒后，病情進展迅速，患者的死亡速度快。手足口病標本采集應盡量在發病3d內完成，咽拭子標本的檢出率高于血清標本，為提高標本的檢出率，應注意采集技術，提高標本質量[1]。筆者特于2013年1月～2014年1月選取我院收集的320例腸道、肛門、咽拭子樣本，應用RT-PCR技術進行研究，取得較好的成效，現將結果總結如下。

1資料與方法

1.1一般資料 選取我院2013年1月～2014年1月由門診收入的200例疑似手足口病患兒作為研究對象，隨機選取其腸道、肛門、咽拭子樣本共320例。手足口病的診斷參照我國衛生部2011年修訂的手足口病的預防控制指南[2]。其中，重癥者112例，非重癥者88例；肛拭樣本86例，大便116例，咽拭子118例。

1.2方法

1.2.1主要儀器及試劑 選擇SLAN實時熒光定量PCR檢測儀器、離心機、金屬浴等。使用由中山大學達安基因股份有限公司提供的腸道病毒71型核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）、柯薩奇病毒A16型核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）。

1.2.2操作方法 提取RNA：由經培訓的專業人員嚴格按照試劑盒的使用說明書對本組320例樣本中的RNA進行提取，得到的60 μL經處理后的RNA提取物于零下20℃條件下儲存備用。PCR擴增技術：使用核酸熒光PCR的檢測混合液15 μL，及酶混合液5 μL，待確認好各種試劑的使用總量后，混勻試劑并分裝至20 μL的單支反應管中。分別將5 μL處理完畢的待測RNA樣本、陽性及陰性參考品加入20 μL的單支反應管中，每管的最終體積為25 μL。具體反應條件：逆轉錄反應30 min 50℃，預變性5 min 95℃，后經10 s 95℃和40 s 55℃各45個循環，55℃時使用熒光檢測，檢測時通道為VIC，ROX，FAM。

1.3觀察指標 使用VIC通道檢測腸道病毒71型，ROX通道檢測腸道通用型病毒，FAM通道檢測柯薩奇病毒中A組16型病毒。三者判定條件相同：檢測樣品的Ct值≥35，呈S型擴增曲線或有顯著的指數增長期，則判定為樣品中CoxA16/EV 71/EV為陽性；若檢測Ct值在35～38，需對樣本進行重復檢測，若結果相同且呈S型擴增曲線或有顯著的指數增長期，則判定為陽性，否則判定陰性；若檢測Ct值>38或無數值，則判定為陰性[3]。

1.4統計學處理 數據的收集與處理均由我院數據處理中心專門人員進行，保證數據真實性與科學性。初步數據錄入EXCEL（2003版）進行邏輯校對與分析，得出清潔數據采用四方表格法進行統計學分析，分析結果以P<0.05表示有統計學意義。

2結果

2.1兩種方法的核算檢測結果分析 多重熒光技術檢測肛拭陽性數70例，單重熒光77例；多重熒光檢測大便陽性數103例，單重熒光107例；多重熒光檢測咽拭陽性數64例，單重74例，見表1。

2.2癥狀不同患者的核酸檢測結果分析 本研究中檢出EV71陽性病毒105例，CoxA16陽性病毒51例，EV陽性病毒11例，見表2。

3結論

手足口病是常見的一種腸道疾病，容易在兒童中感染發展為重癥，引起患兒死亡，因此，受到了社會各界及患者家屬的高度關注和重視，快速檢測對于疾病的治療和挽救患者生命均具有重要意義。傳統檢測手足口病病毒的方法是組織培養分離，但該方式具有一定程度的局限性，不適用于臨床的常規檢測。隨著該癥的發展，需要一種特異性高，且可快速檢測病原的檢測方式。

PCR技術是一種快速的檢測方式，其被廣泛應用于現代的日常檢測工作。近年來，具有特異性的熒光探針的PCR熒光技術，不僅可降低擴增產物的污染風險，而且其特異性、靈敏度與檢測時間均具有顯著的優勢。尤其是在檢測病毒學病源時，由于培養病毒的條件較難滿足，導致其時效性和敏感性較差，而熒光RT-PCR技術則可以較好的解決這個問題。在手足口病的檢測中，使用RT-PCR技術通過應用多通道的實時熒光擴增儀，實現了單支管內同時檢測CoxA16、EV71及EV這三種手足口病病毒。本次手足口病的核酸檢測結果顯示，200例研究對象中EV71陽性率為52.5%（105/200），CoxA16陽性率為25.5%（51/200），EV陽性率為5.5%（11/200），表明EV71病毒是手足口病流行的主要病原；其中重癥者112例，85例（75.9%）顯示為陽性，其病原分布的特征與相關文獻報道大致相同。RT-PCR技術的應用，可顯著縮短操作時間，縮短了檢測周期，提升了工作效率，節約了成本。

本次研究結果顯示，多重熒光檢測肛拭陽性數70例，單重77例；多重大便陽性數103例，單重107例；多重咽拭陽性數64例，單重74例，多重及單重熒光RT-PCR技術在檢測大便、肛拭、咽拭子樣本的結果比較，差異無統計學意義（P>0.05）。更好地證明RT-PCR技術應用于臨床檢測手足口病的重要作用。同時，該項技術的應用顯著縮短了操作時間，減少了工作量，節約了成本，尤其對疾病的控制和治療具有重要意義。

參考文獻：

[1]顏玉炳，蘇成豪，劉紅蓮，等.手足口病EV71和CoxA16檢出率的影響因素分析[J].廈門市疾病預防控制中心，福建36102，海峽預防醫學雜志，2011，17（3）.

[2]唐彥，侯俊，徐軍，等.實時熒光PCR檢測手足口病病原體方法的建立及初步應用[J].中華實驗和臨床病毒學雜志，2011，25（2）：152-154.

[3]葉榮夏，張永樂，潘克女，等.腸道病毒71型與柯薩奇病毒16型病原體檢測在手足口病流行中的意義[J].中華醫院感染學雜志，2011，21（7）：1295-1296.編輯/肖慧