斑馬魚在人類疾病及藥物篩選模型構建中的應用

人類疾病及臨床藥物篩選大多采用鼠類動物來建模。目前，低等脊椎動物斑馬魚作為模式動物已獲得極大的關注。斑馬魚具有多方面的優勢：包括在基因和器官系統上與人類具有很高的同源性，強繁殖力，體外受精，基因易于操作以及整個成年早期身體透明等。本文就近10年來人類疾病及藥物篩選中有關斑馬魚研究的四個領域展開討論。這些領域分別是：①傷口愈合/修復；②胃腸道疾病；③微生物-宿主相互作用；④遺傳性疾病和藥物篩選。

1 創傷愈合/修復

創傷愈合是各種損傷組織和器官的一種重要的生物反應。一系列引起上皮損傷和機體屏障破壞的因素激發了一種被稱為 \"修復\" 的生物反應，它起著封鎖損傷區域，防止其擴散以及重建機體內穩態的作用。這種 \"創傷愈合\" 反應既包括一些上皮細胞遷移到損傷區域，同時也有上皮細胞增殖來補充細胞池等兩部分。認識到這種反應的細胞和分子機制或許就會給那些正遭受著像缺氧癥、燒傷以及癌癥等慢性炎性疾病的患者產生深厚的影響。斑馬魚身體透明，具有很強的成像特點使研究人員在基因操作時更加容易，從而使得這種動物成為研究針對各種損傷的創傷愈合反應的理想模型[1]。此外，斑馬魚所具有較強的肢體和心臟組織再生能力也使得它們成為一種探索再生分子機制的強大動物模型。最有名的斑馬魚損傷模型是仔魚尾巴創傷模型，在此模型中仔魚尾鰭的一段被切除了。研究人員利用這種轉基因斑馬魚的損傷模型在中性粒細胞特有的過氧化物酶催化劑轉錄控制下表達的綠色熒光蛋白（EGFP）研究了最新的中性粒細胞趨化到損傷部位的機制[2]。一些研究人員還把編碼過氧化氫酶的mRNA注射到斑馬魚胚胎發育過程的一個細胞階段去推定活性氧化物H2O2在創傷愈合應答中的作用[3]。在斑馬魚體內，角質細胞產生H2O2來減少軀體感覺軸突的再生。與尾鰭模型相似，神經元的再生也同樣需要過氧化氫酶基因的激活[4]。此外，即使在角質化細胞完好時，隨著神經元的損傷H2O2的變化也能促進軸突再生[5]。這些成果可以擴展到對人類外傷性神經損傷以及其后的四肢功能喪失機制的認識。除了皮膚損傷研究外，斑馬魚還被用于心臟組織再生能力的研究。斑馬魚心臟組織損傷后的反應不同于哺乳動物，后者心臟組織損傷后不可以再生而是形成了疤痕，而斑馬魚在心室被切除了20%后，心臟組織2個月內就可以完全再生[6]。斑馬魚的這種避免疤痕形成的能力需要Mps1（一種有絲分裂關鍵酶）的激活[7]。此外，心臟再生包含了一系列損傷修復基因的上調，同時也可能有血小板衍生生長因子B信號的激活[8]。以斑馬魚為模型的心臟再生研究或許可以獨辟蹊徑，找到對缺血性心臟病患者產生深厚影響的獨特方法。

2 胃腸道疾病

斑馬魚的消化系統與哺乳動物極為相似，同樣包含了一個肝臟、胰腺、膽囊以及一個具有吸收和分泌功能的線性分段的腸道[9-10]。腸上皮在腸道的全程中都發揮著作用且它還包含了許多同樣也能在哺乳動物身上找到的上皮細胞，包括：吸收細胞、杯狀細胞、內分泌細胞等[11-12]。有趣的是，一項還在進行中的基因誘變篩查研究產生了一些發生突變的斑馬魚，它們發生自發性的腸、胰、及肝上皮突變[13]。后來還發現這些突變了的斑馬魚在用了復方阿司匹林處理后，可以導致核β-連環蛋白的堆積以及增加了像cmyc 和axin2這樣的下游基因的表達[14]。而復方阿司匹林誘導人類[15-16]和大鼠[17]發生突變后腸息肉會大量增生，所以這種復方阿司匹林斑馬魚模型或許可以用在基因、藥物篩選以及毒理學研究上。肝腫瘤基因譜分析顯示，人類和斑馬魚之間有132個基因是明顯重疊的[18]。這些基因包括那些涵蓋β-環連蛋白、RSA蛋白激酶信號通路、以及控制細胞粘附和凋亡、在人類和斑馬魚身上都具有的肝特定代謝等過程的基因[19]。肝毒素硫代乙酰胺可引起斑馬魚肝細胞發生癌變。斑馬魚暴露在硫代乙酰胺的環境下12w左右，就可導致與肝細胞癌相關的病理改變[20]。人類肝細胞癌發病率日益增長與HCV感染日益增長密切相關，尤其是感染了具有致癌作用的HCV核心蛋白[21]，這也使得斑馬魚這個模型與人類的疾病密切相關。胰腺癌成為極常見的第四大腫瘤。這可能歸結于有限的診斷工具以及有限的檢查這種疾病的能力。胰腺外分泌細胞是95%以上胰腺癌的罪魁禍首。至今引起人類外分泌性胰腺癌增長的胰腺細胞群還是個未解之迷，但研究人員已開始用斑馬魚模型來探究這個重要的迷。研究人員利用轉基因斑馬魚模型發現當正常的胰腺祖細胞分裂時，熒光標記的轉基因模型魚卻阻止了細胞分裂，反而產生了許多未分裂的祖細胞。而這些祖細胞在經過3～9個月左右就轉化成了創胰腺癌。這些癌細胞同時也表達了大量的頑固性基因以及一些下游頑固性目標基因，這種胰腺癌細胞畸變信號傳導方式也是人類胰腺癌的典型代表[21]。這個首次建立的致癌外分泌腺胰腺祖細胞斑馬魚模型或許會成為胰腺癌的細胞起源。除癌癥模型之外，近幾年來消化系統疾病中一個引起顯著關注的領域是炎癥性腸病（IBD）中斑馬魚造模的發展。在人類，IBD是易感宿主與他們的共生微生物之間相互作用失調的結果[22-23]。藥理治療中應用抗炎藥、免疫抑制劑、以及疾病的外科手術治療也起到一定的作用[24]。一些研究人員試著把這種結腸炎的半抗原惡唑酮模型用成年斑馬魚改進。Brugman等人的研究表明，用惡唑酮處理5h左右的斑馬魚模型腸上皮損傷和杯狀細胞消耗可持續高達7d[25]。2， 4， 6-三硝基苯磺酸（TNBS）可以用來研究急慢性腸炎。把具有3個受精期（dfp）的仔魚暴露于TNBS環境中3～5d可以構建結腸炎斑馬魚仔魚模型[26]。研究人員發現了中性粒細胞浸潤了整個斑馬魚體內，腸內高表達il1b，腸內脂質代謝反應發生了改變，杯狀細胞增生以及腸道收縮等現象[27]。最近，有研究利用非甾體類抗炎藥格拉菲寧建立了斑馬魚上皮細胞損傷模型[28]。

3 微生物-宿主相互作用

應用斑馬魚去探究微生物-宿主相互作用的細胞和分子機制受到廣泛的關注。研究包括人類的許多種疾病中，如炎癥性腸病IBD，肥胖和糖尿病，腸性疾病的治愈，過敏性腸綜合癥等。斑馬魚可以成為革蘭氏陽性及陰性菌、分支桿菌和多種病毒的宿主[29]。斑馬魚是一個研究細菌-宿主相互作用過程的理想模型。一系列比較恒定的探測檢驗點常常可以檢測到細菌及它們相關的物質（像DNA，RNA等）和一些膜結構物（像肽聚糖，LPS-脂蛋白等）。研究最多的細菌相關物質是目前仍有爭議的革蘭陰性菌細胞壁中的LPS。在哺乳動物體內，TLR4可以檢測到LPS，這與其共同受體MD2及CD-14密切相關[30]。與人類相似，高劑量的LPS對斑馬魚也是有毒害作用的[31]。許多研究應用共生的無菌斑馬魚證實了腸道堿性磷酸酶隨著微生物的定居而有所下降[32]。另一個重要的TLR系統是TLR5，它具有監測出鞭毛蛋白和激活多種包含NF-κB的信號通路[33]。與哺乳動物相似，在斑馬魚體內監測出鞭毛蛋白（實驗中是沙門菌屬的衍生物）可以誘導出多種基質金屬蛋白酶基因的表達以及一些像il1b， il8 ，ifn和cxcl-C1c這樣的炎癥標記物[34]。 除了TLRs之外，細胞間的感受器Nod1和Nod2是哺乳動物重要的體內信號系統。在斑馬魚胚胎感染模型中，Nod1或Nod2的損耗都會導致對沙門菌屬易感性的增加[35]。斑馬魚模型這種能在一種針對各種細菌刺激的細胞類型的特殊形式使得它成為一個強大的解釋復雜的宿主-微生物相互作用機制的系統。

4 遺傳性疾病和藥物篩選

斑馬魚具有強大繁殖力、身體透明體的特點，尤其適合遺傳篩選性的研究。可從正反向兩個途徑研究建立新的斑馬魚表現型模型來識別出與許多與人類疾病表現型相關的新基因。也可用一種省時省力的方式篩選斑馬魚疾病模型發現一些疾病抑制藥物。至今，已有兩個重要的途徑在斑馬魚模型中進行正向基因篩選。第一途徑是：用乙基亞硝基脲誘變劑（EUN）處理雄性斑馬魚，接著篩選出具有像腎囊腫或心力衰竭這樣表現型的斑馬魚模型[36]。另一個突變途徑是應用隨機逆轉錄病毒插入[37]。擴張性心肌病（DCM）是心力衰竭病例中至少一半的病因。DCM常源自于因心肌梗塞或感染而引起的早期心臟損傷[38]。斑馬魚篩選模型發現大量的模型魚具有心臟病變。有關研究已發現這些突變體中的兩個sih 和 pickwickm171是通過心肌壁變薄及不完全的收縮引起心臟擴張的[39-40]。因這兩個基因都是熟知的在人類DCM至關重要的作用，所以這些突變體斑馬魚模型是研究這種病理過程模型的補充。近來，利用反向基因途徑已建立了哈欽森-吉爾夫德早衰癥綜合征 （HGPS） 的斑馬魚模型，此病是一種罕見的早衰綜合征。在斑馬魚模型中，研究人員利用可控的功能丟失突變和嗎啉代層蛋白及progerin組合物產生了能夠活到成年的斑馬魚模型。這些模型涵蓋了早期衰老的表型和分子信號，包括：脂肪代謝障礙、異常的肌肉組織以及顱面骨骼結構、細胞凋亡的增加和細胞周期的阻止[41]。這些表型與HGPS患者的臨床表型極為一致，這也進一步驗證了用反向基因途徑去建立人類疾病的斑馬魚模型觀念的可靠性。

自醫學研究之初，動物模型就一直被利用著。大多數人類疾病模型中，小鼠模型毋庸置疑是人類疾病模型中最受偏愛的且應用最廣的動物模型。盡管應用小鼠模型獲得了大量的知識，但是長的妊娠期和性成熟期以及高成本的飼養和繁殖費用都給這個模型的應用帶來了很多重大的限制性。而且，小鼠實驗多需要更多的勞動力且也不是很適合進行高通量藥物篩選。這些限制性都促使發展另外一種在花費高的模型上研究開始之前就可用于提供內部基因或藥物靶點信息研究的模型。透明的、斑馬魚仔魚模型就有填補這個重要位置（即研究人類疾病，促使快速、生理有關的體內篩選）的潛能。隨著斑馬魚和人類之間更多相關基因、解剖以及生理特點的發現，這種脊椎動物模型的相關性及應用就可成為小鼠模型系統的強有力的補充。

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