手足口病病原的熒光PCR法檢測及其臨床特點

摘要：目的 探究手足口病病原的PCR檢測方法及臨床特點。方法 選取我市2012年1月～2013年1月確診為手足口病的患兒40例作為研究對象，取其血液40例及大便標本40例。應(yīng)用熒光PCR檢測法分別對標本中腸道病毒篩選、柯薩奇病毒中A組16型（CVA16）、腸道71型病毒（EV71）進行鑒別，并歸納分析其臨床表現(xiàn)。結(jié)果 40例大便標本檢測顯示，8例CVA16陽性，10例EV71陽性，20例EV-COM陽性。CVA16及EV71陽性的患兒在熱程、體溫、住院時間、尿素氮、血肌酐、AST、ALT比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 對疑似者發(fā)病早期的大便使用熒光PCR檢測，可及時診斷出病原。

關(guān)鍵詞：手足口病；熒光檢測；臨床特點

手足口病（HFMD）是學(xué)齡前兒童中常見的一種急性傳染性疾病，屬于我國法定的報告管理型丙類傳染病。病情嚴重者會導(dǎo)致腦炎、神經(jīng)源肺水腫、無菌性腦膜炎、心肌炎和急性遲緩麻痹等。手足口病的主要致病病毒是腸道71型病毒（EV71）和柯薩奇病毒中A組16型（CVA16）。部分患者在感染手足口病病毒后，病情進展迅速，患者的死亡速度快[1]。筆者特于2012年1月～2013年1月選取我市收集的80例血液、大便樣本，應(yīng)用PCR檢測技術(shù)進行研究，取得較好的成效，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料 選取我市2012年1月～2013年1月收入確診為HFMD的患兒40例作為研究對象，取其血液及大便標本共80例。手足口病的診斷參照我國衛(wèi)生部2011年修訂的手足口病的預(yù)防控制指南[2]。年齡1.1～13.1歲，平均（4.5±1.1），發(fā)病至入院時間0.6～8.1d，平均（4.1±0.7）d。其中，發(fā)熱者40例，口腔潰瘍者38例，手部皮疹者40例，足部皮疹者39例，臀部皮疹者13例。

1.2儀器、試劑和檢測方法

1.2.1主要儀器及試劑 選擇SLAN實時熒光定量PCR檢測儀器、離心機、金屬浴等。使用由江蘇碩世生物科技有限公司提供的腸道病毒71型核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）、柯薩奇病毒A16型核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）。

1.2.2操作方法 所有患兒均在入院當日抽取4ml靜脈血和10g大便標本，靜脈血置放在無菌真空管中，分離血清后，大便滅菌后置入密閉盒中，兩組標本均于零下20℃儲存?zhèn)溆谩ρ寮按蟊銟吮具M行RNA提取及擴增或，由經(jīng)培訓(xùn)的專業(yè)人員嚴格按照相關(guān)試劑及儀器的使用說明書進行操作。

1.3觀察指標 對患兒入院及出院時的肌紅蛋白、腎功能、肌鈣蛋白、肝功能及血常規(guī)等進行檢測。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)的收集與處理均由我單位數(shù)據(jù)處理中心專門人員進行，保證數(shù)據(jù)真實性與科學(xué)性。初步數(shù)據(jù)錄入EXCEL（2003版）進行邏輯校對與分析，得出清潔數(shù)據(jù)采用四方表格法進行統(tǒng)計學(xué)分析，分析結(jié)果以P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1血清標本檢驗結(jié)果 本組患兒PCR檢測結(jié)果顯示，40例血清標本中，未檢出陽性病例。

2.2大便標本檢驗結(jié)果 40例大便標本PCR檢測結(jié)果顯示，CVA16陽性者8例，EV71陽性者10例，EV-COM陽性者20例。EV-COM陽性患兒大便標本的采集時間為發(fā)病4.2d左右，前3d采集標本中的陽性病例比例為80%；EV-COM陰性患兒大便標本的采集時間為發(fā)病6.2d左右，EV-COM陽性及陰性標本采集時間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.2164，P=0.0384）。

2.3不同病原的致病患兒相關(guān)指標分析，見表1。

2.4不同病原的致病患兒相關(guān)指標分析，見表2。

3討論

HFMD是常見的一種腸道疾病，容易在兒童中感染發(fā)展為重癥，引起患兒死亡。其常見的病原有埃可病毒、柯薩奇病毒及EV71。傳統(tǒng)檢測HFMD病毒的方法是組織培養(yǎng)分離，但該方式具有一定程度的局限性，不適用于臨床的常規(guī)檢測[2]。

通過對40例患兒研究中的臨床表現(xiàn)看，手足臀皮疹、發(fā)熱和口腔潰瘍?nèi)匀皇荋FMD的癥狀特征。研究中40例患兒血清中未檢出陽性病毒，這可能與病毒血癥的持續(xù)時間短或患兒血液內(nèi)病毒水平較低相關(guān)；大便標本中的陽性病毒檢出率達50%，與皰疹液和咽拭子中的檢出率相近（60%）[3]。在20例通用型試劑盒的陽性檢測中，CVA16及EV71陽性陽性感染分別為8例和10例，表明CVA16及EV71是HFMD的主要病原體，其它病毒的感染相對少見，如埃可病毒等。同時也說明，通用型試劑盒在HFMD病院的檢測診斷中具有顯著的實用性，可應(yīng)用在病原學(xué)的篩查中[4]。研究中對CVA16及EV71感染患者進行對比后發(fā)現(xiàn)，兩組患者的臨床癥狀基本相同，其嚴重程度也無大的區(qū)別，本研究中的EV71病毒感染者均未出現(xiàn)心肌炎、腦膜炎等嚴重疾病，可能與患兒間個體間差異、病毒變異或病毒血癥持續(xù)時間較短相關(guān)，其具體原因還有待進一步的研究確定[5]。在患病過程中應(yīng)對EV71型病原感染者著重護理，避免患兒出現(xiàn)嚴重的腦、心、肺等并發(fā)癥。相關(guān)研究顯示[6]，在發(fā)病早期對患者大便進行檢測，可提高病原學(xué)檢出率。研究中所有樣本均在患者入院當天采集，檢出率高可能與該樣本采集時間較早相關(guān)；同時研究所用試劑盒可在單支管中同時對腸道病毒、CA16及EV71型病毒進行檢測，且能準確對CA16及EV71型病毒進行區(qū)分鑒別，其他相關(guān)RT-PCR檢測時一般為單支管單純檢測一個目的基因，其可能對檢測過程及其靈敏度產(chǎn)生影響[7]。通用型腸道病毒檢測在HFMD的病原學(xué)檢測和診斷中有重要的意義及實用價值，可應(yīng)用于其病原學(xué)的篩查中。相關(guān)學(xué)者研究后指出[8]，皰疹液及咽拭子在經(jīng)病毒分離后的檢出率較高，臨床檢測時結(jié)合皰疹液、咽拭子，可明顯提高HFMD病原學(xué)診斷的成功率。為后期HFMD的病原學(xué)檢測提供了新途徑。

綜上所述，HFMD是常見腸道疾病，其臨床常見表現(xiàn)為手足臀皮疹、發(fā)熱和口腔潰瘍。臨床中對HFMD的病原檢測可使用熒光PCR法，該方式應(yīng)用于早期檢測，可及時準確地診斷出其病原，值得進一步推廣及應(yīng)用。

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