Exendin—4干預對2型糖尿病腎病大鼠腎組織HO—1表達的影響

摘要：目的 觀察Exendin-4干預對糖尿病腎病（DN）大鼠腎組織NT和HO-1蛋白和mRNA表達的影響。方法 高糖高脂飼料結合鏈脲佐菌素（40mg/kg）建立DN大鼠模型，隨機分為DN組、低劑量干預組和高劑量干預組，并與正常大鼠比較，免疫組化法觀察NT和HO-1蛋白表達的變化，RT-PCR法觀察mRNA表達的變化。結果 HO-1主要在腎小管上表達。與正常大鼠相比，DN組HO-1表達顯著降低（P<0.001）；經Exendin-4低劑量干預和高劑量干預后HO-1表達顯著增加（P<0.001）。結論 Exendin-4通過增強HO-1表達進而降低氧化應激以保護DN大鼠腎臟。

關鍵詞：糖尿病；腎病

2型糖尿病（diabetes mellitus， DM）是一種慢性遺傳相關性疾病，后期常合并糖尿病腎病（diabetic nephropathy， DN）等微血管并發癥，極大的增加了患者殘疾和死亡的風險[1，2]。當前認為，DN的發病和進展是在遺傳學背景的基礎上，腎組織糖脂肪代謝紊亂、氧化應激等多因素綜合作用的結果[3]。血紅素氧合酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）由氧化應激誘發[4]，是血紅素分解代謝過程中的限速酶，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化和抗增值等細胞保護作用[5]。課題組前期發現GLP-1類似物Exendin-4通過降低免疫炎性反應和延緩纖維化進程進而保護DN大鼠腎臟，而尚未闡明氧化應激機制是否參與Exendin-4的腎臟保護作用。為此，我們建立大鼠DN模型，制備腎臟組織切片，觀察Exendin-4干預對HO-1 蛋白和mRNA表達的影響，以闡明Exendin-4保護腎臟的潛在氧化應激機制。

1資料與方法

1.1一般資料 ♂SD大鼠40只（山西醫科大學實驗動物中心），200～220g。鏈脲佐菌素（Sigma-Aldrich），Exendin-4針劑（東莞寶麗健）。兔抗鼠HO-1多克隆抗體（北京博奧森），DAB染色試劑盒（北京博奧森），RNA提取試劑盒（北京康為世紀）。BI-2000醫學圖像分析系統（成都泰盟）。

1.2方法

1.2.1 2型DN模型大鼠的構建 30只大鼠適應性喂養1w后，給予高脂高糖飼料喂養4w，第5w結束時依大鼠體重腹腔注射鏈脲佐菌素（40mg/kg），第6w結束時測尾靜脈隨機血糖濃度（>16.65mol/l提示DM建模成功）。第10w結束時收集24尿量，測24h尿微量白蛋白含量（>30mg/（kg·d）提示DN建模成功，成功率80%）。整個建模期間，均不使用降糖藥物；并將DN大鼠隨機分為無干預組、Exendin-4低劑量干預組和高劑量干預組，每組8只。8只正常大鼠作為對照組，常規飼料喂養10w。

1.2.2 Exendin-4干預方法 DN建模成功后次日，低劑量干預組皮下注射4μg/（kg·d）的Exendin-4，高劑量干預組給予20μg/（kg·d）的Exendin-4，連續給藥6w。監測體重1次/w，依據體重變化調整藥物劑量。

1.2.3留取腎組織標本 大鼠斷頭處死，立即取出雙側腎臟。左腎置于4%的多聚甲醛中固定，常規石蠟包埋切片，行免疫組化研究；右腎置于凍存管中并在超低溫冰箱中保存，行RT-PCR研究。

1.2.4 HO-1蛋白表達（免疫組化法） 石蠟切片脫蠟至水，H2O2室溫孵育以消除內源性過氧化物酶，PBS緩沖液沖洗5min×3次，高壓熱修復組織抗原，山羊血清封閉，滴加兔抗大鼠HO-1抗體（1：50稀釋）、4℃過夜，PBS緩沖液沖洗、滴加辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG，PBS緩沖液沖洗、DAB顯色、蘇木精復染，封片保存。顯微鏡下觀察：HO-1陽性表達體現為細胞漿呈棕黃色或棕褐色。BI-2000醫學圖像分析系統觀察五個視野，并計算視野中陽性表達的平均灰度值。

1.2.5 HO-1mRNA表達（RT-PCR法） 剪取腎組織50mg，按照經典法[6]依次加入Trizol（1ml）、氯仿（200μl），異丙醇（與上清液等體積）提取總RNA。按照試劑盒說明進行逆轉錄和擴增，反應體系20μl，PCR反應條件：94℃預變性10min，活化Tag酶；PCR反應94℃15s，延伸60℃60 s，45個循環結束。引物序列由上海生工生物科技有限公司合成，β- actin：上游5'-GTC AGG TCA TCA CTA TCG GCA AT- 3'，下游5'-AGA GGT CTT TAC GGA TGT CAA CGT- 3'，產物長度147bp；HO-1：上游5'-CAC GCA TAT ACC CGC TAC CT- 3'，下游5' -AAG GCG GTC TTA GCC TCT TC- 3'，產物長度1602bp。熒光定量PCR儀讀取CT值，利用2-ΔΔCT法進行定量分析。

1.2.6統計分析 實驗結果以x±s表示，應用SPSS13.0軟件作統計學分析，各實驗組間差異性采用單因素方差分析。

2結果

2.1免疫組化結果 HO-1蛋白在正常組、Exendin-4低劑量干預組和高劑量干預組腎小管均有表達，但在DN組表達較弱或幾乎不表達，各組間差異具有統計學意義（F=99.2，P<0.001），見表1和圖1。

2.2 PCR結果 HO-1mRNA在正常組和Exendin-4高劑量干預組顯著表達，且二者表達量接近；在DN組表達較弱或幾乎不表達，經Exendin-4低劑量干預后表達提升，且以Exendin-4高劑量干預后提升顯著；各組間差異具有統計學意義（F=110.8，P<0.001）。

3討論

DN是DM患者常見、重要且難治的慢性微血管并發癥，最終導致終末期腎病和腎衰竭[7]，從而使患者被迫選擇腎移植或者透析治療，導致患者生存率及生活質量下降，同時增加家庭和社會的醫療負擔。

Exendin-4是從蜥蜴唾液腺分泌的多肽（由38個氨基酸縮合形成），具有增加胰島β細胞釋放胰島素、降低胰高血糖素分泌、保護心血管和腎臟的效應。HO-1常視為誘導型應激蛋白標記物，對缺血再灌注損傷[8]和糖尿病[9]誘發的急慢性腎損傷具有保護作用。Yamagishi S[10]等發現氧化應激參與高糖環境誘發的腎臟等微血管損傷，并最終導致DN。為此，我們推斷降糖藥和DN治療藥可能通過降低氧化應激水平來發揮保護腎臟的作用。

本研究發現HO-1的蛋白和mRNA在正常大鼠腎組織中顯著表達，而在DN大鼠腎組織中不表達或輕微表達，驗證了氧化應激參與了糖尿病腎病的進展。在給予了Exendin-4干預后，HO-1的蛋白和mRNA表達隨著Exendin-4的劑量增加而增加，提示Exendin-4通過降低氧化應激水平而延緩糖尿病腎病的進展，為系統闡明Exendin-4保護腎臟的機制奠定實驗依據。

參考文獻：

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[10]Yamagishi S， Imaizumi T. Diabetic vascular complications： pathophysiology， biochemical basis and potential therapeutic strategy[J]. Curr Pharm Des， 2005， 11 （18）：2279-2299.

編輯/申磊