離心力、時間對富血小板血漿中生長因子濃度的影響

摘要：目的 探索應用不同的離心速度來制備的富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）中TGF生長因子的含量，并做相關分析，嘗試闡明制備PRP最合適的離心次數及速度。方法 采集自愿者外周血200ml，應用EDTA抗凝，4°保存以備用。應用全自動血液分析儀進行血小板計數，采用二次離心法（不同的離心速度、時間）分離出PRP，再次用全自動血液分析儀進行血小板計數，然后用ELISA法檢測所得的PRP中的TGF-β的濃度。結果 外周血中的血小板濃度為146.36×109L，PRP的血小板濃度為（757.27±55.07）×109L。PRP中的TGF-β濃度為（737.68±62.7）ng/ml。其中以900g，10min，700g，10min，這個離心速度與時間組合所得的PRP血小板濃度及TGF-β濃度最高（881.5×109L，824.2 ng/ml）。結論 PRP的制備的質量與離心速度，離心時間密切相關，合適的離心速度，時間可以得到高濃度并富含生長因子的PRP。

關鍵詞：富血小板血漿；TGF-β；離心

富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是通過離心人或動物的的全血而得到的高體積分數的血小板血漿，富含多種生長因子[1，2]，其中與創傷、促進成骨相關的是其中的轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β。TGF-β可促進前成骨細胞的趨化和有絲分裂，增進膠原基質的合成， 同時抑制破骨細胞的生成和骨吸收，從而對創傷的愈合和骨組織再生起促進作用。IGF可促進前骨細胞向成骨細胞分化，刺激成骨細胞的骨形成， 在移植骨和骨松質內的許多細胞膜上存在著PDGF和TGF-β等因子的受體，如成骨細胞和前成骨細胞，當加入PRP后，高質量分數的生長因子加大了這些細胞的活化。

當前PRP的制備方案分為機器制備以及手工二次離心法兩大類。手工二次離心法所制備PRP雖在制備成功率，時效等方面不如機器制備，但其所需要用到的儀器叫少，方法簡便，所以目前仍是實驗室少量應用PRP的主要制備方法。然而不合適的離心條件（速度，時間），對于PRP的制備重大的影響，會直接降低PRP的產出。

1資料與方法

1.1實驗標本 采集一健康的自愿者的外周血200ml，自愿者標準：符合《中華人民共和國獻血法》及《獻血體格檢查標準》，RGB大于11g/L，血小板計數大于1.5×109L；乙肝兩對半陰性，輸血三項陰性；無心腦血管疾病，年齡25～40歲之間，男女不限。

1.2實驗材料 EDTA抗凝劑（北京美科美生物技術開發有限公司）；TGF-β ELISA試劑盒（RD system）；2ml、15ml、50ml離心管（Corning），精密移液器（eppendorf Research plus 2.5ul 10ul 200ul 1000ul）高速冷凍離心機（eppendorf centrifuge 5702R，Thermo LEGEND Micro 21R）；全自動酶標儀（Thermo MULTISKAN MK3；全自動血液分析儀（SYSMEX KX-21）；倒置顯微鏡（奧林巴斯 CKX41）。

1.3實驗方法

1.3.1外周血采集 以預裝EDTA抗凝的采血袋，無菌操作下采集志愿者肘部靜脈血200ml，搖勻，存放于4°C冰箱以備用。

1.3.2 PRP離心制備 從采集外周血起，2h內4°C冰箱中取出外周血，全程均在超凈臺中進行無菌操作，將外周血分裝于15ml試管中。共分6組，每組3管，每組采取不同的離心速度和離心時間進行PRP的制備（離心機：eppendorf centrifuge 5702R），見表1。采用4°C進行第一次離心，離心后去除大上層大部分血漿，留約1ml血漿，用精密移液器吸取血漿及PRP層，及以下的1mm血細胞，移至另一試管；再次以4°C離心，離心后用精密移液器小心去除最底層紅細胞，所剩余液體重懸后即為PRP。制備流程見圖1。

1.3.3檢測指標

1.3.3.1全自動血液分析儀檢測外周血及6種不同的離心方法所得的PRP中的血小板含量

1.3.3.2 TGF-β濃度測定 在制備的PRP中加入350u/ml的PRP激活劑（10%氯化鈣，10%牛血清白蛋白，凝血酶，雙蒸水），靜置1min后即可看到PRP形成凝膠狀，用0.22um針式過濾器過濾后即得到激活后富含生長因子的PRP。按照ELISA試劑盒說明進行TGF-β的濃度測定。

2結果

2.1全自動血液分析儀檢測血小板含量。外周血與其余6種離心方案的血小板計數分別為：146.3×109L，699.54×109L，747.02×109L，723.28×109L，797.86×109L，847.30×109L，728.63×109L，見圖2。以SPSS 17.0進行統計分析得PRP血小板計數為（757.27±55.07）×109L，PRP血小板濃度將近原外周血濃度5倍，表明所有離心方案均能制備PRP，但離心方案5所取得的血小板濃度更高。

2.2根據ELISA試劑盒檢測TGF-β濃度，6種離心方案制備的PRP，為了去除手工移除紅細胞時可能會去除部分血小板的誤差，每種離心方案均重復進行3遍，制備的PRP均用以檢測TGF因子，6種離心方案制備的PRP中所含TGF因子的均數分別為：689.24ng/ml，714.82ng/ml，736.94ng/ml，898.28ng/ml，824.2ng/ml，662.64ng/ml。（圖3）以SPSS 17.0進行統計分析樣本均數及標準差得（737.68±62.7）ng/ml。

4討論

富血小板血漿的手工制備過程中受到眾多因素的影響。PRP離心制備的原理在于通過離心使外周血中的成分分離，得以提取。但鑒于血小板較脆弱，容易破裂激活，從而使得生長因子在仍未到達所需作用部位即已激活，影響PRP的價效，所以國內外學者對于二次離心法制備PRP進行了諸多的相關研究，如Sonnleitner[3]等應用了我們本次試驗中的離心方案2的離心方法：160g，20min，400g，15min； Landesberg[4]等應用200g，10min，200g 10min兩次同樣的離心時間以及離心速度進行PRP的制備，亦取得不錯的效果（離心方法1）；Petrungaro[5]等用1500g，6min，1500g，6min，進行分離（離心方法6）；Aghaloo法，215g，10min，863g，10min，即本實驗所用的方法3；盧萌[6]等用第一次200g，10min，第二次1200g，10min，來進行離心，也同樣分離出高濃度的PRP（方案4）。

在本試驗中，我們嘗試了前人所采用的數種二次離心法，發現第一次離心力度如果不夠，會導致離心后血漿層較渾濁，血小板聚集層較薄，此時如棄去血漿層，將可能導致的血小板丟失，對PRP的濃度產生一定的影響，即便是第二次離心時用更高的離心力與更長的時間，亦無法提高PRP的濃度。經過我們多次調整離心力度與時間，發現第一次離心條件4℃，900g，10min，第二次離心條件4℃，700g，10min，最為理想。所得到的PRP血小板計數最高。

PRP在凝血酶激活后可釋放大量的生長因子[1，2]，我們用ELISA來檢測其中的較為關鍵的TGF生長因子，通過對比，發現在第一次離心條件4℃，900g，10min，第二次離心條件4℃，700g，10min，ELISA檢測的TGF-β濃度為824.2 ng/ml。這與PRP血小板計數呈正相關。

此外，為保證實驗數據的可靠性，我們每種離心方法均由同一人員操作3遍并取平均值。第一次離心后將剩余血漿、血小板移至另一試管的過程也尤為關鍵。應盡量吸取所有的血小板層，而盡量少吸取最下層的紅細胞。第二次離心后，應用10ul的細長移液器吸頭吸除最下層剩余的紅細胞，動作應盡量輕柔，以免紅細胞濺灑在PRP內，對后續的實驗、治療產生影響。

綜上所述，第一次以900g離心，10min，第二次以700g離心，10min，這個離心力與時間組合所得的PRP血小板濃度及TGF-β濃度最高（881.5×109L，824.2 ng/ml），所以PRP的制備的質量與離心速度，離心時間密切相關，合適的離心力度，時間可以得到高濃度的、TGF濃度較高的PRP。

參考文獻：

[1]Weibrich G， Kleis WK， Hafner G，et al.Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age， sex， and platelet count[J].J Craniomaxillofac Surg，2002，30（2）：97-102.

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[3]Sonnleitner D，Huemer P，Sullivan DY.A simplified technique for producing platelet-rich plasma and platelet concentrate for intraoral bone grafting techniques： a technical note[J].Int J Oral Maxillofac Im-plants， 2000， 15（6）： 879-882.

[4]Landesberg R，Roy M，Glickman RS.Quantification of growth factor evels using a simplified method of platelet-rich plasma gel preparation[J].J Oral Maxillofac Surg，2000， 58（3）：297-301.

[5]Petrungaro PS.Using platelet-rich plasma to accelerate soft tissue maturation in esthetic periodontal surgery[J].Compend Contin Educ Dent，2001， 22（9）：729-732， 734.

[6]盧萌，陳偉輝，王承勇，等.不同離心方法制備富血小板血漿對血小板濃度及其活性的影響[J].中國口腔種植學雜志，2008，13（4）：166-170.

編輯/申磊