全饑餓狀態對大鼠腦損傷及復食后學習記憶功能的影響

摘要：目的 通過測定血清S100B蛋白，NSE的濃度探討全饑餓狀態對大鼠腦損傷的影響及大鼠復食后對其學習記憶的影響。方法 采用饑餓大鼠模型，將80只成年健康雄性SD大鼠按體質量隨機分成分為兩組，即全饑餓組（A組：n=40），復食組（B組：n=40）組。A組又分為5個亞組：A-Ⅰ組為正常對照組，A-Ⅱ、A-Ⅲ、A-Ⅳ、A-Ⅴ組分別為全饑餓3 d、5 d、7 d、9 d組，每組n=8。B組也分為5個亞組：B-Ⅰ組為正常對照組，B-Ⅱ、B-Ⅲ、B-Ⅳ、B-Ⅴ組分別為全饑餓3d、5d、7d、9d后給予恢復進食組組，每組n=8。結果 A-Ⅱ組、A-Ⅲ組大鼠饑餓后，血清中S100B蛋白含量與NSE含量比較A組均下降，下降幅度 A-Ⅲ組> A-Ⅱ組。其中A-Ⅱ組與對照A-Ⅰ組比較無明顯差別（P>0.05），A-Ⅲ組與A-Ⅰ組比較有差異性（P<0.05）。A-Ⅳ組、A-Ⅴ組血清中S100B蛋白含量與NSE含量比較A-Ⅰ組均上升，但A-Ⅳ組與A-ⅠA組比較無明顯差異（P>0.05），A-Ⅴ組與A-Ⅰ組比較差異明顯（P<0.05），有統計學意義。水迷宮實驗中，前6 d定位航行試驗中B-Ⅱ、B-Ⅲ組與對照B-Ⅰ組比較其上臺前平均時間均縮短，其中第1 d和第2 d與對照組比較有明顯差異（P<0.05）。其余無明顯差異（P>0.05）。B-Ⅳ組與對照B-Ⅰ組比較上臺前時間均延長但無明顯差異（P>0.05）。B-Ⅴ組對照B-Ⅰ組比較上臺前時間均延長，其中第1、4 d上臺前時間與對照B-Ⅰ組比較有明顯差異（P<0.05）。饑餓后復食組平均速度與對照組無差異（P>0.05）。第7 d空間搜索試驗中撤平臺后B-Ⅱ、B-Ⅲ組其站臺穿越次數大于對照B-Ⅰ組，但是無差異（P>0.05），站臺停留時間百分比大于對照B-Ⅰ組但是無差異（P>0.05）。B-Ⅳ、B-Ⅴ組其站臺穿越次數小于對照B-Ⅰ組，但是無差異（P>0.05）。站臺停留時間百分比小于對照B-Ⅰ組并且有統計學意義（P<0.05）。結論 大鼠饑餓3 d、5 d、7 d后無腦損傷發生，饑餓9 d后有腦損傷發生。復食7 d后對其學習記憶有一定的影響。

關鍵詞：饑餓；S100B蛋白；神經元特異性烯醇化酶；水迷宮；酶聯免疫分析法

近年來，我國礦難的發生順位發生了質的變化，由原來的瓦斯爆炸事故、井下透水事故、冒頂塌方事故……改變成了井下透水事故、瓦斯爆炸事故、冒頂塌方事故……。因此，冒頂塌方事故發生后被困員工的生命支持以及各臟器功能的保護則成為了礦山創傷研究的重點。我國井下被困員工持續時間最長可達25 d。那是2009年7月12日，貴州黔西南州晴隆縣中營鎮新橋煤礦透水事故發生后，在井下400 m處救出3名礦工，被困井下25 d，計604 h。這些長時間被困井下人員都有一個共同的特點--在有空氣可吸的前提下，有水喝，因無食物供應處于全饑餓狀態。如此長時間饑餓狀態對腦功能有何影響？被解救和復食后對腦的復健又有和影響？是尚未闡明的一個問題，這對于指導井下被困者生命支持和醫療救治具有重要堵塞意義。本研究則旨在通過實驗研究，初步了解全饑餓狀態對大鼠腦損傷及復食后學習記憶功能的影響。

1資料與方法

1.1一般資料 成年健康雄性SD大鼠（由河北聯合大學實驗動物中心提供，動物批號：SYXK（冀 2010-0038）80只，體質量（319±15）g。按體質量隨機分成分為兩組，即全饑餓組（A組：n=40），復食組（B組：n=40）組。A組又分為5個亞組：A-Ⅰ組為正常對照組，A-Ⅱ、A-Ⅲ、A-Ⅳ、A-Ⅴ組分別為全饑餓3d、5d、7d、9d組，每組n=8。B組也分為5個亞組：B-Ⅰ組為正常對照組，B-Ⅱ、B-Ⅲ、B-Ⅳ、B-Ⅴ組分別為全饑餓3 d、5 d、7 d、9 d后給予恢復進食組組，每組n=8。

A組大鼠為正常自由飲水、完全斷食后3 d、5 d、7 d、9 d取血測定S100B蛋白和NSE。

B組為A組大鼠為正常自由飲水、完全斷食后3 d、5 d、7 d、9 d給予流質飲食，持續喂養7 d后開始做1次/d水迷宮實驗，共6 d。

1.2方法 實驗期無飼料供應自由攝水直至被活殺。饑餓開始當日上午處死對照組A-Ⅰ組大鼠。以后分別于饑餓3 d、5 d、7 d、9 d上午同一時間處死A-Ⅱ、A-Ⅲ、A-Ⅳ、A-Ⅴ大鼠。大鼠麻醉后固定于手術臺上，在無菌操作條件下剖開腹部用去熱原采血針抽取腹主動脈血4 mL，裝入去熱原的真空采血管內，靜置30 min。5000 r/min離心5 min分離血漿后立即將血漿置于-80℃冰箱保存、待測。血漿中S100B蛋白、NSE的測定按照酶聯免疫分析（ELLSA）法測定。

復食組對照組B-Ⅰ（n=8）給予正常飲食由流食開始逐漸恢復正常飲食。B-Ⅱ、B-Ⅲ、B-Ⅳ、B-Ⅴ禁食后由流食開始逐漸恢復正常飲食。復食7 d后通過Morris水迷宮及其軟件系統記錄大鼠連續6 d的定位航行試驗，檢測大鼠的空間學習能力，平臺放在第4象限，記錄潛伏期（大鼠的入水到四肢爬上站臺時所需的時間即上臺前時間），同時記錄大鼠入水后的游泳軌跡及速度，大鼠爬上站臺后，讓其在站臺上站立30 s。若大鼠在入水后120 s內未能找到池中的站臺或未能爬上站臺，系統自動停止記錄，潛伏期為120 s，有測試者引導其上臺。在測試第7 d的空間搜索試驗時撤除水池中的平臺，然后將大鼠面向與平臺象限相背象限的迷宮池壁中點放入水中，記錄大鼠在60 s內的平臺象限停留百分比以及穿越原平臺相應位置的次數并記錄大鼠在60 s內搜索平臺的軌跡圖，以檢測大鼠對原平臺（目標象限）的記憶保持能力。

1.3統計學處理 使用SPSS17.0軟件包對所得數據進行分析，所得實驗數據以（x±s）表示。采用多因素方差分析，以P<0.05表示差異存在顯著性。

2結果

2.1饑餓大鼠各組血清S100B、NSE水平變化規律 饑餓組血清S100B、NSE水平在饑餓3 d后開始降低，至第5 d降至最低，此后逐漸升高，第9 d升至最高。對照組血清S100B、NSE水平相對穩定且不隨時間延長而發生明顯變化，見表1。

2.2復食后各組大鼠學習記憶實驗結果 水迷宮實驗中，前6 d定位航行試驗中G、H組與對照F組比較其上臺前平均時間均縮短，其中第1 d和第2 d與對照組比較有明顯差異（P<0.05）。其余無明顯差異（P>0.05）。I組與對照F組比較上臺前時間均延長但無明顯差異（P>0.05）。J組對照F組比較上臺前時間均延長，其中第1、4 d上臺前時間與對照F組比較有明顯差異（P<0.05）。饑餓后復食組平均速度與對照組無差異（P>0.05）。第7 d空間搜索試驗中撤平臺后G、H組其站臺穿越次數大于對照F組，但是無差異（P>0.05），站臺停留時間百分比大于對照E組但是無差異（P>0.05）。I、J組其站臺穿越次數小于對照F組，但是無差異（P>0.05）。站臺停留時間百分比小于對照E組并且有統計學意義（P<0.05），見表2～4。

3討論

3.1持續性全饑餓對腦細胞能夠造成損傷 S100B蛋白是一種酸性鈣結合蛋白[1]，它在腦組織中含量豐富，遠高于其他組織。其主要功能是膠質源性營養作用，調節細胞的可塑性，參與信息傳遞，調節細胞代謝，調節鈣離子濃度等[2-5]。S100B蛋白濃度升高提示細胞壞死或血腦屏障（Blood-brain barrier， BBB）通透性增高， Naeimi 等[6]認為S100B蛋白作為中樞神經系統疾病的生化標志物，其水平變化程度可反映腦膠質細胞損傷的嚴重程度。神經元特異性烯醇化酶（NSE）是糖酵解過程中烯醇化酶的同工酶，NSE在腦組織中含量最高[7]。正常狀態下NSE在血清、腦脊中含量極低。神經元細胞損傷崩解，血腦屏障通透性增加，是血清中NSE水平增高的兩個主要原因，可作為評判顱腦損傷的重要指標，且與神經元的損傷呈正相關。本實驗中選用S100B蛋白和NSE兩個生化，既可以反應膠質細胞損傷，又可以反應神經元的損傷程度。實驗結果發現，全饑餓狀態下的大鼠，血清腫的 S100B蛋白、NSE水平在3 d后開始降低，至第5 d降至最低，此后反而逐漸升高，第9 d升至最高（P<0.05）。這可能是由于在前期饑餓的應激狀態下，會出現復雜的神經一內分泌系統介導的適應性變化，選擇性內臟血管痙攣以保持心腦等重要臟器的血液供應[8]，腦神經元細胞和膠質細胞維持正常的基本結構和功能。全饑餓持續到一定時限，腦細胞則會因代謝紊亂而導致細胞內酸中毒-細胞損傷。高濃度的S100B蛋白、NSE又對神經細胞產生毒性作用，從而會導致神經細胞凋亡[9-10]，由此可以推斷，如果大鼠全饑餓狀態持續5 d以上，即使給予復食也則可能遺留學習與記憶功能的下降。

3.2全饑餓復食后對學習與記憶的影響 認知功能障礙是腦損傷后最持久的后遺癥，主要表現為學習、記憶、注意和判斷等能力的減弱[11]。水迷宮實驗是經典的研究大鼠認知功能的方法。本實驗在大鼠饑餓3、5、7、9 d后，由流食逐漸恢復飲食，通過預實驗觀察監測復食至第7 d，動物的外觀、體能狀態均恢復至饑餓前的水平，排除了體力等因素對實驗結果的影響。在本水迷宮實驗中，在平均速度無差異的情況下，前6 d定位航行試驗中G、H組與對照F組比較其上臺前平均時間均縮短，其中第1 d和第2 d與對照組比較有明顯差異（P<0.05）。表明短期饑餓對動物的學習過程確實有一定的影響，但對其記憶過程無顯著性影響。這一結果與饑餓3 d、5 d血清中S100B蛋白、NSE檢測的意義相一致。但饑餓時隨著血糖水平的下降大腦等中樞神經系統的功能也明顯下降，有實驗證明低血糖會導致大鼠的學習記憶和辨別功能下降，錯誤增加，可見饑餓對神經系統的影響非常明顯[12]。在本實驗中I組與對照F組比較上臺前時間均延長，站臺穿越次數小于對照F組，但是均無差異，表明饑餓7 d復食組對大鼠的學習記憶均不造成影響，雖然站臺停留時間百分比小于對照F組并且有統計學意義，可能是因為樣本數量小的原因。這一結果與饑餓7 d后血清中S100B蛋白、NSE檢測的意義大致一致。J組對照F組比較上臺前時間均延長，其中第1、4 d上臺前時間與對照F組比較有明顯差異，J組其站臺穿越次數小于對照F組，站臺停留時間百分比小于對照F組并且差異顯著，表明長期饑餓對大鼠的學習記憶有一定的影響。這一結果與饑餓9 d后血清中S100B蛋白、NSE檢測的意義相一致。由此可見：適度應激刺激有助于學習記憶功能的提高，當人或動物處于強烈的應激其學習記憶能力會受到明顯的影響，這些結論也是與Coburn-Litvak[13]等的研究結果相同。

4結論

本實驗通過檢測饑餓狀態下大鼠血清S100B蛋白、NSE水平變化，提示連續饑餓超過7 d可能發生腦組織損傷。盡管饑餓9 d后恢復飲食，亦可對大鼠的學習記憶能力遺留不良的影響。

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編輯/張燕