酶比色法檢測血同型半胱氨酸應用評價

摘要：目的 建立簡便的酶比色法測定血中同型半胱氨酸的方法，并與傳統的酶循環法相比較，評價同型半胱氨酸酶比色法臨床檢測的可行性。方法 通過精密度試驗、線性、干擾實驗，考察方法的可靠性，最后采用加樣回收的方法比較兩種方法的準確性，并對臨床30份血液樣品進行了酶比色法檢測。結果 酶比色法具有很高的精密度，較寬的線性范圍，抗干擾能力較強，更高的回收率。結論 同型半胱氨酸酶比色法原理檢測試劑與目前常用的酶循環法檢測試劑相比，酶比色法具有更高的準確性，可用于臨床同型半胱氨酸的檢測。

關鍵詞：酶比色法； 酶循環法；同型半胱氨酸；臨床檢測

同型半胱氨酸（Homocysteine， Hcy），即2-氨酸-4巰基丁酸，是一種體內蛋氨酸代謝過程中產生的中間產物[1～3]。眾多的臨床研究與細胞實驗已經證實高同型半胱氨酸血癥與冠狀動脈疾病、腦血管疾病、外周血管疾病等多種血管相關性疾病息息相關[4～7]。研究也發現同型半胱氨酸與糖尿病腎病等疾病相關[8，9]。血漿中Hcy測定已成為國外診斷維生素B12及葉酸缺乏、早期心腦血管疾病監控療效的常規方法[10，11]。檢測同型半胱氨酸常用方法包括放射酶分析法[12]、酶聯免疫法[13]、氣相色譜-質譜 （GC - M S ） 聯用法、HPLC法[14]、酶比色法[15]、循環酶法[16]、熒光偏振免疫分析法、高效毛細管電泳法及顆粒增強免疫比濁法[17]。但放射酶分析法存在放射性，操作繁瑣；氣相色譜-質譜聯用法和HPLC法操作繁瑣，耗時長，儀器價格昂貴；熒光偏振免疫法需要特殊儀器；高效毛細管電泳法，靈敏度相對偏低；酶比色法和循環酶法是臨床最常用的同型半胱氨酸，操作方便，耗時較短，不需要衍生等復雜操作。本研究通過對比酶比色法與循環酶法兩種同型半胱氨酸檢測方法的結果的比較，評價兩種檢測方法的臨床適用性，研究時間2013年6 月～9月，報告如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 MS205型分析天平（瑞士，梅特勒-托利多），日立7180全自動生化分析儀（日本，株式會社日立制作所）。

1.2 試劑 同型半胱氨酸檢測試劑盒（酶比色法，重慶中元生物技術有限公司生產）；同型半胱氨酸檢測試劑盒檢測試劑（循環酶法，四川省邁克科技有限公司）；Hcy（美國，Sigma公司）；乳糜（西安立邦制藥有限公司）；血紅蛋白（牛血紅蛋白，北京經科宏達生物公司）；膽紅素（北京經科宏達生物公司）；抗壞血酸等其他試劑均為國產分析純。試劑均于4℃下低溫保存。

1.3 血清樣本 選擇30份2013年6 月～9月于我院就診的患者，空腹采血后，加入肝素抗凝后， 離心分離血漿，-20℃冷凍保存，并用同型半胱氨酸檢測試劑盒（酶比色法和酶循環法）在日立7180全自動生化分析儀進行測定。

2 方法

2.1 操作方法 酶比色法試劑盒和酶循環法試劑盒測定參數設置和操作嚴格按照試劑盒廠家說明書規定進行。

2.2 評價方法 按產品執行標準及《臨床化學體外診斷試劑盒質量檢驗總則》對試劑的精密度、線性范圍、抗干擾性進行評價，最后采用加樣回收的方法比較兩種方法的準確性，并對臨床30份血液樣品進行了酶比色法檢測。

2.3 精密度實驗 取高、中、低濃度的Hcy質控液各1份，用酶比色法連續測定20次，分別測定質控液的日內和日間重復性。

2.4 線性和范圍 選擇50.00μmol/L的Hcy質控液，用緩沖溶液逐倍稀釋成6個不同濃度的標本，用酶比色法重復測定3次，將測定值（Y）與理論值（X）進行線性回歸分析。

2.5 干擾實驗 以12.0 μmol/L的Hcy質控液為基礎，加入不同濃度的乳糜、血紅蛋白、膽紅素和抗壞血酸進行干擾實驗，用酶比色法測定后計算結果偏差。

2.6 回收率 取已知含量的血漿9份，分別加入含量為12.0、24.0、36.0μmol/L的Hcy質控液，每個濃度各三份。用酶比色法和酶循環法分別測定后，計算回收率。

2.7 臨床樣品測定 采用酶比色法對臨床30份樣品進行Hcy濃度測定，每個樣品重復測定3次。

3 結果

3.1 精密度實驗通過 高、中、低濃度精密度結果比較，結果表明，本方法的日間精密度的RSD值為2.1%～2.7%，日內精密度為1.7～2.5%，RSD值均小于5%，表明方法精密度良好。

3.2線性和范圍通過理論值與實測值的回歸方程，結果表明，理論值和實測值之間的回歸方程為y=0.9857x+0.4528，相關系數（r）為0.9974，表明線性范圍為1.56～50μmol/L。

3.3 干擾實驗經過酶比色法測定血漿Hcy的抗干擾實驗結果，由干擾實驗可知，乳糜、血紅蛋白、膽紅素和抗壞血酸均會對實驗測定結果產生影響，但總體影響不大，均能達到《臨床化學體外診斷試劑盒質量檢驗總則》的要求。

3.4 回收率 見表1。

由表1可知，酶比色法的平均回收率為99.3%，酶循環法平均回收率為93.2%，且酶循環法每一份樣品的回收率都偏小。當樣品含量較小的時候，如2μmol/L 時，測定結果可能偏小，甚至低于檢測線性范圍。所以酶比色法具有更高的準確性，更適合臨床樣品的檢測，特別是健康人群的同型半胱氨酸的測定。

3.5 臨床樣品檢驗結果 采用建立的酶比色法對臨床樣品進行含量測定，測得的結果，見表2。

4結論

由于同型半胱氨酸具有重要的臨床意義，對多種疾病的具有重要的指示作用，隨著其檢測技術的發展，對其研究也逐漸深入。本研究通過精密度試驗、線性、干擾實驗，考察酶比色法的可靠性，最后采用加樣回收的方法比較酶比色法和酶循環法的準確性，最后對臨床30份血液樣品進行了酶比色法檢測，結果表明同型半胱氨酸酶比色法原理檢測試劑與目前常用的酶循環法檢測試劑，酶比色法具有更高的準確性，可用于臨床同型半胱氨酸的檢測。

參考文獻：

[1]王鴻利. 同型半胱氨酸的檢測及其應用[J]. 診斷學理論與實踐， 2002，1（4）： 257-261.

[2] 陳琦玲，王及華，馬濟順，等. 同型半胱氨酸對高血壓腦卒中患者血脂和頸動脈斑塊的影響[J].中國動脈硬化雜志， 2002， 10（4）： 345-346.

[3] 張卓偉，柳潔，張華屏. 同型半胱氨酸對高糖培養的人血管內皮細胞ICAM-1表達的影響[J]. 中西醫結合心腦血管病雜志， 2013， 11（10）： 1233-1235..

[4]薄濤.高同型半胱氨酸血癥與高血壓及冠心病相關分析[J].慢性病學雜志， 2010， 12（5）：425-426.

[5]相春霞，鄧婉秋，杜迎. 葉酸和B族維生素對急性腦梗死患者高同型半胱氨酸血癥的研究[J].北京醫學， 2009， 31（7）：443～444.

[6]Benedetta De Chiara， Valentina Sedda， Marina Parolini， et al. Plasma total cysteine and cardiovascular risk burden： action and interaction[J]. Scientific World Journal， 2012， doi：10.1100/2012/303654.

[7]杜萱， 吳暢. 同型（半）胱氨酸與動脈粥樣硬化[J].中華心血管病雜志， 2000，28（3）：239-240.

[8]張志強，袁石文，黃志勇. 血清同型半胱氨酸檢測在糖尿病腎病中的臨床意義[J]. 現代醫院，2012，12（6）：80-82.

[9]唐敏娟. 同型半胱氨酸及胱抑素C在糖尿病腎病早期診斷中的應用[D].桂林：桂林醫學院，2013.

[10]Ertugrul DT，Karadag AS，et al.Serum holotranscobalamine，vitamin B12，folic acid and homocysteine levels in alopecia areata patients[J].Doi：10.3109/15569527.2012.

[11]Ueland PM，Refsum H，Stabler SP，et al.Total homocysteine in plasma or serum：methods and clinical application[J].Clin Chem，1993；39（9）：1764-1779.

編輯/王海靜