回生口服液藥物血清對人肺癌A549 細胞增殖及周期的影響

摘要：目的 觀察回生口服液藥物血清對人肺癌細胞A549 增殖及周期的影響。方法 大鼠灌胃制備回生口服液藥物血清，采用MTT 法觀察藥物血清干預24、48、72 h 后對細胞增殖的作用（分為空白組及藥物血清高、中、低劑量組）；采用流式細胞檢測分析藥物血清干預24h 對細胞周期的影響（分為空白組、空白組及藥物血清高、中、低劑量組）。結果 各藥物血清組與空白組之間的吸光度差異有統計學意義（P<0.05），隨著作用時間的延長，其吸光度逐漸降低，抑制率逐漸增高（P<0.05）。藥物血清組細胞周期G1 期增多，G2 期及S 期減少。結論 益氣化瘀養陰解毒方對肺癌細胞具有抑制作用，可能與其抑制細胞分裂有關。

關鍵詞：回生口服液；細胞增殖；細胞周期；人肺癌細胞系A549；藥物血清

1 資料與方法

1.1細胞株、藥物與動物 人肺癌A549 細胞，購自中國科學院上海生命科學院細胞庫；回生口服液購自成都地奧集團天府藥業股份有限公司，國藥準字Z20025042；SD 大鼠購自四川大學華西醫學中心動物實驗中心，質量200～250g。

1.2主要試劑與儀器 RPMI1640 培養基（Gibco 公司），新生牛血清（中科晨宇（北京）貿易有限公司），胰蛋白酶（Sigma），噻唑藍（Sigma），二甲基亞砜DMSO（上海卒瑞生物科技有限公司）。低速離心機、超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），CO2 恒溫孵育箱，倒置生物顯微鏡（Olympus），96 孔培養板（CORNING）， FACSAria 流式細胞分選儀（美國BD公司）。

1.3方法

1.3.1藥物血清制備 選用正常成年大鼠16 只，雌雄各半。每日灌胃回生口服液，劑量根據臨床等效量折算比例換算，分為高、中、低劑量回生口服液組，藥物換算后劑量為低劑量（20mg/kg/d）組、中劑量（40mg/kg/d）組、高劑量（80mg/kg/d）組；空白組大鼠每日灌胃等量生理鹽水。灌胃前12h 禁食不禁水，2次/d，連續3d 后禁食，于第4d最后1次灌胃1h進行腹主動脈采血，1800r/min 離心10min，合并同組動物血清，用0.22μm微孔濾器過濾除菌，-20℃保存。使用時以1640 培養基稀釋。

1.3.2人肺癌細胞的培養 人肺癌A549 細胞株，用含10%新生牛血清的1640 培養基于37℃、5%CO2 培養箱中培養。細胞鋪滿80%～90%時開始傳代，約1～2d傳代1 次。

1.4指標檢測 采用MTT法[4-5]。細胞以含2%新生牛血清的1640 培養基培養24h后，胰酶消化， 1640 培養基配成細胞懸液，濃度5×104/mL，種入96 孔板，每孔200μl細胞懸液。板周邊的孔以無菌PBS填充，防止邊緣效應。在37℃、5%CO2的培養箱內培養16h后，每組設5個平行孔，于24h、48h、72h時間點，分別加入MTT 溶液20μl繼續培養4h 后，終止培養，吸去培養液，加入DMSO， 在搖床上輕輕振蕩10min，在酶聯免疫檢測儀上測定各吸光度值（A 值），比色時以空白孔調零。根據公式計算細胞生長抑制率（IR）：IR=（空白組A值-給藥組A 值）/對照組A 值×100%。

1.5數據統計 應用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，各組數據以均數±標準差（x±s）表示，均數間比較采用方差分析，率的比較用χ2檢驗，P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1抑制肺癌A549 細胞增殖的作用 回生口服液不同濃度藥物血清與空白組之間的細胞吸光度差異均有統計學意義（P<0.05），且隨作用時間延長，抑制率隨之增高（P<0.05）；中劑量組抑制癌細胞增殖的作用強于低劑量組（P<0.05），見表1。

2.2加藥24h后對A549 細胞周期的影響 加藥后24h， 含藥血清組G1 期細胞數目比例增多，與空白組之間有統計學意義差異（P<0.05），見表2。

3 討論

本實驗經流式細胞檢測發現，回生口服液干預的細胞組，G1 期細胞明顯增多，說明該抗腫瘤中藥抑制人肺癌A549 細胞增殖的機理可能為阻滯其細胞分裂，使較多的肺癌細胞處于分裂抑制的G1期，為進一步研究抗復方中藥的作用機制奠定了基礎，課題組下一步擬通過調控A549增殖的信號通路切入，探索中醫藥調控癌細胞增殖的詳細機制[1-3]。

參考文獻：

[1]陳煥偉，凌華梅，趙小瓊.回生口服液聯合地榆升白片輔助治療晚期非小細胞肺癌的療效觀察[J].現代中西醫結合雜志2004， 139（22）： 2960-2961.

[2]周繼華.回生口服液治療晚期惡性腫瘤的臨床觀察[J].西南國防醫藥，2000，10（6）：346-347.

[3]方喜生，關明媚，劉國龍，等.回生口服液預防非小細胞肺癌化療所致骨髓抑制觀察[J].中國中醫藥咨訊， 2009， 1（6）： 40-41.編輯/哈濤