12種藏醫常用藥材抗結核分枝桿菌活性篩選

摘要：目的 觀察12種藏醫常用藥材對結核分枝桿菌標準菌株H37Rv的體外抗菌活性。方法 取適量的12種藏醫常用藥材制備其水及/或乙醇粗提物，比例法檢測各粗提物對結核分枝桿菌H37Rv菌株的抗菌MIC。結果 試驗藥材中紅花的水及乙醇粗提物MIC分別為5.86 mg/ml和0.74mg/ml，對H37Rv抗菌活性最強。唐古特青蘭、藏墊雪靈芝和短穗兔耳草的水提取物具有較明顯的抗菌活性，MIC分別為18.75mg/ml、18.75mg/ml和46.88mg/ml。其他各藥材抗菌活性較弱，其MIC均大于50mg/ml。結論 所試12種藏醫常用藥材中紅花、唐古特青蘭、雪靈芝和短穗兔耳草均具有不同程度的體外抗結核分枝桿菌活性。

關鍵詞：結核分枝桿菌；藏藥；藥物敏感性試驗

結核病是由結核分枝桿菌引起的傳染病，由于耐藥及耐多藥結核分枝桿菌（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）的出現， 結核病合并HIV感染以及人群流動性增加等原因， 結核病在全球的流行再次呈現上升態勢[1]。自上世紀四十年代第一個抗結核分枝桿菌藥物-鏈霉素及其后的異煙肼、利福平等藥物應用于臨床以來， 雖然人們已研發出近20種抗結核分枝桿菌的藥物， 但均存在副作用大， 易產生耐藥性等缺點[2]，而且新藥物的研發遠不及細菌耐藥性形成的速度。因此，從豐富的傳統中藥資源中尋找有效的抗結核藥物，受到人們越來越多的重視。

為了尋找具有明顯抗結核分枝桿菌的天然藥物用于臨床結核病的治療，本研究對12種藏醫常用藥材進行了體外抗結核分枝桿菌H37RV菌株的藥物敏感性試驗，現將初步篩選結果報告如下：

1資料與方法

1.1 一般資料 結核分枝桿菌標準菌株H37Rv（ATCC27294），國家疾病預防控制中心惠贈，西藏大學醫學院病原生物學實驗室真空冷凍保存。

1.2試驗藥材 試驗用藏藥材樣品產地、來源、鑒定人、藥用部位及提取溶媒見表1。

1.3培養基 改良羅氏培養基。制備方法參考\"結核病診斷細菌學檢驗規程\"進行[3]。

1.4實驗方法

1.4.1試驗樣品的制備 稱取各藥材粗粉適量，1：10加入1000ml純水或乙醇，室溫下浸泡24h，60～70℃回流提取3次，2h/次，濾除藥渣，合并濾液，濾液60～70℃旋轉蒸發濃縮至適當體積或浸膏，部分藥物浸膏以真空冷凍干燥至粉末。不同樣品提取用溶劑見表1。取各藥物提取物適量，以滅菌0.5%吐溫-80生理鹽水溶解即為試驗藥物原液，-80℃存放備用。部分提取物加入適量吐溫-80助溶。試驗藥物原液使用時以滅菌0.5%吐溫-80生理鹽水2倍稀釋成若干稀釋度使用。

1.4.2藏藥培養基的制備 基礎培養基仍采用改良羅氏培養基， 改良羅氏培養基中的水分以試驗藥物原液及稀釋液代替， 孔雀綠溶液的配制、全卵液的勻化、培養基的凝固及保存等同改良羅氏培養基的制備。

1.4.3菌懸液制備 刮取改良羅氏培養基表面生長2w之結核分枝桿菌H37RV培養物（需刮取斜面各個部分的培養物）置于磨菌器底部，使用磨菌棒研磨使呈乳酪狀，以滅菌0.5%吐溫-80生理鹽水稀釋，與1號標準麥氏比濁管比濁，即配成1mg/ml的菌懸液。

1.4.4接種與培養 將1mg/ml的菌懸液10倍稀釋至10-2mg/ml。以滅菌吸管準確吸取菌液0.1ml分別接種于含藥培養基及對照培養基斜面上，每管接種菌量為10-3mg。置37℃培養，4w后觀察結果。待空白對照管菌落生長至培養基斜面1/3以上時終止培養，對照培養基菌落在200以下者不納入研究范圍。

1.4.5計算耐藥百分比 （含藥培養基表面生長菌落數/對照培養基表面生長菌落數）×100%， 若耐藥百分比小于1%， 則認為受試菌對該濃度藥物敏感，反之則為不敏感。

2結果

12種試驗藥物水和/或乙醇粗提物對結核分枝桿菌的最低抑制濃度（ minimal inhibitory concentration， MIC ）結果見表1。結果表明，12種試驗藥材中紅花的水和乙醇粗提物MIC分別為5.86mg/ml和0.74mg/ml，對H37Rv的抗菌活性最強，且80%乙醇粗提物活性優于水提取物。其次，具有較明顯抗菌活性的依次為唐古特青蘭、藏墊雪靈芝和短穗兔耳草的水提取物，其MIC分別為18.75mg/ml、18.75mg/ml和46.88mg/ml。其他各藥活性較弱，其MIC均大于50 mg/ml，其中螃蟹甲和烏雙龍膽在試驗藥物的第一個稀釋度即無抗菌活性。

3討論

我國傳統中醫藥對結核病的治療已有2000余年的歷史。藏醫藥是我國民族醫藥的一枝奇葩，不僅對疾病具有獨特的認識和用藥習慣，而且由于西藏地處青藏高原，常年高寒缺氧、紫外線輻射強，日照充足、空氣干燥，這些獨特的生境可能促使藏醫藥用植物產生具有更高藥理活性的成分，甚至獨有的藥理活性成分。

本實驗嘗試從藏醫臨床常用藥材中初步篩選體外具有抗結核分枝桿菌活性的藏醫用藥物。實驗結果顯示在所選試驗藥物中大部分具有不同程度的體外抗菌活性，其中尤以紅花作用最為明顯，此與宋玉宗等[4]的報道相一致，但其作用稍弱，其可能原因為我們實驗所采用的方法為絕對濃度法，而其為液體稀釋法，前者不及后者對藥物濃度的測試精準。

唐古特青蘭、藏墊雪靈芝、短穗兔耳草均為藏醫常用藥材，有研究顯示三者均具有一定的體外抗菌活性。短穗兔耳草主要用于發熱、腎炎、肺病、引道流黃黑色液物等疾病[5]，張忠以及楊云裳[6]研究顯示其粗提物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌及熒光假單胞菌都有抑菌活性，MIC最低可達0.05g/ml；雪靈芝是一種重要的民間草藥， 常用于治療感冒、肺炎、黃疸、風濕癥、淋巴結核、腎結石、子宮病等[7]，鮑敏等[8]采用濾紙片擴散法測試雪靈芝的水及乙醇提取物對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、梭狀桿菌等均有不同程度的抑制作用。另外，也有研究提示唐古特青蘭亦具有一定的抗菌活性[9]。但有關這三種常用藥材抗結核分枝桿菌的情況則未見報道。在本實驗中三者的水提取物均表現有較好的抗菌活性。雖然紫金標、草木犀[10，11]等其余藥材也有文獻顯示具有抗菌活性，但在本實驗中顯示的抗菌活性均較低。

中草藥種類繁多， 各種藥物成分復雜。雖然大多中草藥的抗菌機制目前仍不清楚， 但一般認為其作用是多靶點的，菌體不易對其形成耐藥性。具抗菌活性的中草藥不但可直接作用于病原菌本身， 同時也可能通過調節全身機能狀態、提高機體免疫力而發揮抗菌作用。因此， 從天然藥物中篩選和研究毒副作用小且不易產生耐藥性的抗結核分枝桿菌新藥具有廣闊的前景，對結核病的防控，特別是耐藥結核病的治療具有重要的意義。

參考文獻：

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[3]中國防癆協會.結核病診斷細菌學檢驗規程[J].中國防癆雜志，1996，18（2）：80-85.

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[5]中科院西北高原生物研究所.藏藥志[M].西寧：青海人民出版社，1991：447.

[6]張忠，李科瑋，畢陽，等.兩種兔耳草提取物的體外抑菌作用[J].食品工業科技，2012，9：62-64.

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[8]鮑敏，米琴，曾陽.藏藥雪靈芝不同提取物的體外抑菌作用實驗研究[J].青海師范大學學報（自然科學版），2005，4：87-89.

[9]廖敬禮，顧健，鐘鋒，等.藏藥唐古特青蘭的研究進展[J].中國民族民間醫藥雜志，2010，11：132-134.

[10]叢建民，陳鳳清，孫春玲，等.草木犀黃酮提取工藝優化及抑菌活性研究[J].白城師范學院學報，2012，5：18-24.

[11]楊家強，宋寶安.紫金標提取物抗菌活性的研究[J].安徽農業科學，2011，93（6）：3313-3315.

編輯/申磊