地中海貧血基因診斷研究

摘要：地中海貧血是一組因珠蛋白肽鏈合成障礙而導致的遺傳性溶血性貧血，目前對地中海貧血尚無有效的治療方法。基因診斷是通過對受檢者某一特定基因（DNA）或某轉錄物（mRNA）進行分析來診斷遺傳病的技術，已成為最為普遍的地中海貧血常規檢測方法，又被稱為是診斷地中海貧血的金標準。本文綜述了地中海貧血基因診斷的研究進展。

關鍵詞：地中海貧血；基因診斷

地中海貧血（Thalassemia）是由于血紅蛋白基因的突變導致珠蛋白鏈的合成不平衡所造成的一類常見的單基因遺傳性、溶血性疾病。包括α地中海貧血和β地中海貧血兩種類型，是世界上最常見和發病率最高的遺傳性溶血性貧血，也是危害最嚴重的血紅蛋白病之一。目前對地中海貧血尚無有效的治療方法，因此快捷有效的診斷技術在地中海貧血干預中極為重要。隨著分子診斷學的不斷發展，特別是基因診斷技術的應用，臨床對地中海貧血的診斷、鑒定變得簡單、準確[1]，使地中海貧血的基因診斷成為普遍的常規檢測方法。本文就有關地中海貧血基因診斷研究進展作一綜述。

1 α地中海貧血

α地中海貧血是由于α珠蛋白基因缺失，或非缺失突變導致α珠蛋白鏈功能異常，或合成減少而引起的一種遺傳性溶血性疾病。目前世界上至少發現了35種缺失，中國人中發現了7種（3種α+地中海貧血和4種α0地中海貧血），最常見的為東南亞型（--SEA型）。少數α地中海貧血由基因突變引起，中國人最常見的3種為HbCS、HbQS和HbWM[2]。

1.1跨越斷裂位點PCR（gap-PCR） 這是最常用的針對缺失型突變的檢測方法。在α珠蛋白生成障礙性貧血中，以缺失型常見，除了常見的缺失類型外，也可能存在一些尚未發現的缺失型珠蛋白生成障礙性貧血，同樣都可以利用gap-PCR技術進行分析和鑒定[3]。李友瓊等[4]運用gap-PCR技術對1例罕見的巴氏水腫胎兒進行基因分析鑒定，表明針對大片段缺失的基因型，可以通過在其上、下游設計特異引物，利用gap-PCR技術進行分析和鑒定。結論證實gap-PCR技術可以用于鑒定未知缺失突變的珠蛋白生成障礙性貧血基因型。

1.2多重PCR（multiplex-PCR，M-PCR）多重PCR是基于gap-PCR原理設計的PCR技術，該技術可快速、準確檢測α地貧的東南亞缺失（-SEA）、右缺失（-α3.7）和左缺失（-α4.2），具有簡便快速、準確實用而又經濟等特點，非常適合于我國以預防為主而開展的大人群地中海貧血的分子篩查和臨床樣品的基因診斷[5]。肖奇志等[6]研究提出單管多重PCR和反向斑點雜交（RDB）技術均能分別準確檢出常見缺失型和非缺失型α-地貧各種突變類型，如將兩者結合分析，還能提供相互佐證的重要信息，表明單管多重PCR結合RDB技術同時應用于α-地貧的基因診斷，可保證產前診斷的可靠性。

1.3實時熒光定量PCR（realtime PCR）該技術原理是在PCR反應體系中加人熒光基團，在特定的定量PCR儀上完成，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR進程，從而得到一條熒光擴增曲線，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法[7]。該方法具有檢測快速、通量高、操作簡便、不易污染等優點。彭建明等[8]通過將多重熒光定量PCR法與常用的gap -PCR法進行比較，無論是對正常標本還是對缺失型α地貧基因型的標本，檢測結果都表現出100%的準確性，研究表明此方法操作快速準確，簡單可行，低成本高通量，易于實現自動化及標準化，適應大規模檢測。袁曉文等[9]采用雙重TaqMan實時熒光嵌套PCR技術檢測50份α地貧SEA缺失已知基因型標本，結果顯示該方法不但能實現其快速分子診斷，而且能準確判斷受檢標本中的外源性污染，從而有效避免假陰性或假陽性誤診。Fallah等[10]建立的用于檢測未知缺失類型α-地貧的實時熒光定量PCR可檢測出72.4%的未知缺失類型α-地貧，不僅可用于檢測α-珠蛋白基因的缺失，還適用于其他類型的基因分型。

1.4多重連接探針擴增法（ multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）該技術是另外一種可選擇的用于檢測未知缺失型地中海貧血的分子診斷技術。MLPA結合了DNA探針雜交和PCR技術，但也有其局限性：需要精確測量DNA的濃度，樣本容易被污染；MLPA用于檢測基因的缺失或重復，不適合檢測未知的點突變類型[11]。Liu等[12]建立了以MLPA檢測缺失型（-SEA、-α3.7，-α4.2）及非缺失型（α-CSα、α-QSα）α-地貧的方法，其檢測的結果完全與多重PCR檢測結果相一致。陳亞軍等[13]對75份檢出α地貧表型特征樣本采用常規跨越裂點PCR（gap-PCR）技術及反向斑點雜交（RDB）法檢測α地貧基因缺失及點突變，采用MLPA技術檢測α珠蛋白基因缺失；產前診斷采用gap-PCR和MLPA法對胎兒標本進行α地貧基因缺失檢測。得出結論：MLPA是α地貧基因缺失常規gap-PCR檢測方法的有效補充，可防止α地貧基因缺失的漏診及產前診斷中的假陽性或假陰性誤診。

2 β地中海貧血

β地中海貧血的分子基礎是珠蛋白基因的點突變或核苷酸序列缺失，造成β珠蛋白鏈合成的減少或缺如。β珠蛋白基因突變主要分為兩大類：一類是非缺失型突變，包括轉錄突變、RN加工突變、翻譯突變、顯性遺傳性β地中海貧血和高度不穩定性血紅蛋白、轉錄起始點突變、起始密碼子突變、非翻譯區突變、PolyA加合信號的突變。另一類是缺失型突變。目前世界范圍內已報道200多種β基因突變類型，中國人中已發現34種，以 CD17（A→T）、CD41/42（-TTCT）、IVS-Ⅱ-654（C→T）、-28M（A→G）和CD71-72（+A）5種熱點突變最多見，約占突變類型的90%[14]。

2.1反向點雜交（reverse dot blot，RDB） 該技術是目前國內外最常用的技術。其優點在于一張雜交膜上可同時篩查多種點突變，從而改變了傳統雜交法一次只能檢測一種突變的方式。尤其適合β地貧這類突變位點較多的遺傳病的檢測。李敏敏等[15]應用反向點雜交法檢測出1種新的罕見β地中海貧血突變類型，即位于β珠蛋白exonl的CD27（GCC-GAC）突變。陳碧艷等[16]用同樣的方法檢測出罕見β珠蛋白-86（C>G）基因，豐富了中國人β地中海貧血的突變譜。趙華等[17]將PCR-RDB方法與血紅蛋白電泳聯合，對100 例臨床標本進行檢測，結果陽性率為46.8%，研究證實血紅蛋白電泳聯合基因診斷可以準確區分突變類型的純合子、雜合子、雙重雜合子及正?；?，是目前診斷β-地中海貧血患者和杜絕重型地中海貧血患兒出生之有效的實驗方法。

2.2基于實時PCR的溶解曲線分析 近年來，基于實時PCR的溶解曲線分析方法檢測地貧的突變基因在臨床上受到越來越多的關注和應用?；谠摷夹g主要有二類方法，①基于實時PCR的熒光標記探針溶解曲線分析（melting curve analysis，MCA），②高分辨率溶解曲線分析（high resolution melting analysis，HRM）。實時熒光PCR具有靈敏度高、重復性好、定量準確、自動化程度高、特異性更強和全封閉反應等優點。肖奇志等[18]采用針對我國β地貧24種基因突變的四色MCA試劑盒檢測了187份臨床標本，并與PCR-RDB進行對照，同時以DNA測序技術作為金標準進行了性能評價；結果顯示診斷效率大于98%。研究還提出臨床實驗室特別是產前診斷實驗室在采用RDB法檢測β地貧基因突變時，很有必要同時應用基于PMCA技術對檢測結果進行確證，以保證β地貧基因診斷和產前診斷結果的可靠性。嚴提珍等[19]也用同一方法檢測了45l份外周血樣本和84份胎兒絨毛、羊水、臍帶血產前診斷樣本，并與PCR-RDB進行對照，不一致者用基因測序法驗證，結果顯示該方法具有很好的診斷特性。廖燦等[20]對30例高風險胎兒家系進行HRM曲線分析，然后與RDB及DNA測序結果進行比對，結果完全一致，符合率為100%。研究證實基于MCA和HRM方法具有快速、簡便、高通量、靈敏度高、特異性強、性價比高等優點，非常適合在臨床上廣泛開展應用。

2.3 DNA測序 是最直接最準確的判斷突變的位置和性質的方法，盡管費用相對較高，仍然是檢測未知的地貧突變基因的關鍵方法。通過設計突變位點兩端的引物進行PCR，然后進行測序可以確定突變的具體位置和性質。目前，基因測序已經在地中海貧血稀有突變患者的產前診斷中有所應用，潘小英[21]等利用DNA 測序檢測出5種β-地貧稀有基因突變型，分別是beta nt1582（A>G），PolyA（AATAAA>GATAAA）；CD13/14（-C）；beta nt 1586（A>G），PolyA（AATAAA>AATAGA）；IVS-1-1（G>T）；IVS-2-2（-T），其中前2種為新發現的β-地貧基因突變類型，得出結論：對常規基因檢測技術不能診斷的β-地貧疑似病例，可作DNA測序進行確診。宋春林[22]等檢測出CD6、CD56、CD22 三種稀有β地貧突變，研究表明聯合反向點雜交和直接基因測序技術可為攜帶稀有β地中海貧血基因突變的夫婦提供產前基因診斷。葉國永[23]等聯合應用MLPA技術，PCR技術和基因測序技術檢測100例臨床樣本，說明MLPA技術與基因測序技術的聯合應用可用于臨床常規應用。

3結論

基因診斷是地貧診斷的金標準。地中海貧血基因診斷技術經過多年的發展，已成為一項成熟的技術， 無論從速度、效果、敏感度、自動化程度、分析成本等方面，傳統方法是無法比擬的。目前用于地貧基因診斷的方法較多，本文只敘述了其中幾項，這些方法各有特色和優缺點，不同實驗室可根據自身的技術優勢和經驗以及對患者疾病的判斷等因素而考慮使用何種方法?；蛟\斷對操作人員和設備要求較高，應特別注意其穩定性和準確性。為提高地中海貧血診斷的準確性，減少誤診和漏診，應將基因診斷法和其他方法有機結合起來。相信在不久的將來，地中海貧血的基因診斷技術將更加成熟、完善。

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編輯/張燕