X射線照射后Rac1蛋白對慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞凋亡的影響

摘要：目的 探究電離輻射后Rac1蛋白對K562細(xì)胞凋亡的影響。方法 不同劑量X射線照射K562細(xì)胞，藻紅B染色檢測不同時間點細(xì)胞凋亡率，Western blot分析不同時間點Rac1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 隨著照射劑量的增加和時間的延長，細(xì)胞凋亡率有上升的趨勢；電離輻射后總的Rac1蛋白表達(dá)未發(fā)生明顯變化，隨著時間延長Rac1蛋白表達(dá)量逐漸減少。結(jié)論 Racl蛋白表達(dá)的減少能夠促進(jìn)K562細(xì)胞的凋亡，其可能成為腫瘤基因治療新的靶點。

關(guān)鍵詞：X射線； Rac1；凋亡

Racl全稱為Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1，基因全長29Kb，定位于人染色體7p22，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有1.2kb和2.5kb兩種，均在組織特異性高的組織中表達(dá)[1，2]，Rac1蛋白主要通過影響細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞的遷移，細(xì)胞周期進(jìn)，基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，細(xì)胞的增殖、凋亡，血管形成等多方面來對腫瘤起作用。本次實驗主要研究Rac1蛋白對輻射誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制。

1資料與方法

1.1一般資料 K562細(xì)胞株購自上海中科院細(xì)胞研究所，RPMI-1640培養(yǎng)基為四季青公司產(chǎn)品，新生牛血清為Gibco產(chǎn)品，藻紅B染色購于上海四季青公司，兔抗Rac1（c-14）多克隆抗體、羊抗兔IgG二抗、兔源性抗人Actin抗體均購自美國Santa Cruz公司，直線加速器購于西門子公司（劑量率200cGy/min）。

1.2細(xì)胞凋亡分析 K562細(xì)胞用含有10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，X射線分0、2、4、8 Gy四個劑量點照射對數(shù)生長期K562細(xì)胞，于照后24h和72h收集細(xì)胞，用染料藻紅B﹙Erythrosine B﹚對細(xì)胞染色，活細(xì)胞不能被染色，死細(xì)胞的核被染成紅色，根據(jù)被染色細(xì)胞占總觀察細(xì)胞的百分率計算細(xì)胞的凋亡率，每次處理觀察200個細(xì)胞。

1.3 Western blot 0、2、4、8 Gy的X射線照射對數(shù)生長期K562細(xì)胞，于24 h、72h收集細(xì)胞，用含苯甲基磺酰氟的裂解液提取細(xì)胞總蛋白，未經(jīng)照射的細(xì)胞作為對照組，BCA法測定蛋白濃度，等量蛋白上樣，12%SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5% 脫脂奶粉室溫封閉3h。洗膜后加入兔抗Rac1（c-14）多克隆抗體（1：1000稀釋）封閉2h，TBST洗膜3次，10min/次，加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1：2000稀釋）37℃ 雜交1h，曝光、顯影、定影。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。劑量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用均數(shù)t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同劑量X射線照射K562細(xì)胞的凋亡率 用0、2、4、8 Gy的X射線照射K562細(xì)胞，分別在24h、72h時收集細(xì)胞，藻紅B染色的方法檢測細(xì)胞的凋亡率，由表1可以看出，隨著劑量的增加，兩個時間點的凋亡率亦增加，呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性。由表1亦可看出受照后72h的細(xì)胞凋亡率明顯高于24h的細(xì)胞凋亡率。

2.2 X射線照射后K562細(xì)胞中Rac1蛋白表達(dá)變化 0、2、4、8Gy的X射線照射K562細(xì)胞后，由圖1可見總的Rac1蛋白表達(dá)未發(fā)生明顯變化，72h時Rac1蛋白表達(dá)水平比24h時Rac1蛋白表達(dá)水平有所減少。

3討論

細(xì)胞凋亡（apoptosis）是正常機(jī)體細(xì)胞在受到刺激后出現(xiàn)的一種自發(fā)的程序性死亡過程，它是一個能被抑制或激活的可調(diào)節(jié)過程，調(diào)節(jié)失衡則是腫瘤產(chǎn)生的一個重要機(jī)制。電離輻射可通過直接或間接作用抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本實驗所選的K562細(xì)胞在8GyX射照射后72h時細(xì)胞的凋亡率僅約13%，表現(xiàn)出一定程度的電離輻射抗性，但隨著照射劑量的增加和時間的延長，K562細(xì)胞凋亡率有逐漸升高趨勢，呈現(xiàn)時間、劑量依賴性。而Racl作為Rho蛋白家族中的重要一員，是Ras基因的下游分子，參與了ras基因的惡性轉(zhuǎn)型，而其本身也是個癌基因，它的激活也可以導(dǎo)致細(xì)胞的癌變[3]。有研究發(fā)現(xiàn)它在宮頸癌、結(jié)腸癌 、胰腺癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，其主要通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增值、侵襲和轉(zhuǎn)移在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4-8]。有研究發(fā)現(xiàn)活化的Rac1可促進(jìn)整合素類蛋白分子在細(xì)胞頭部表面募集，進(jìn)而誘導(dǎo)肌動蛋白微絲聚集于細(xì)胞質(zhì)膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜多極化，從而影響細(xì)胞的運動遷移，它還可以激活Ⅳ型膠原酶，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲穿透能力。Rac1也可通過調(diào)節(jié)NF-kB活性及增加細(xì)胞內(nèi)超氧化物陰離子的濃度進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。Rac1有可能作為反映腫瘤生物學(xué)行為的一種新型標(biāo)志物。本研究采用不同劑量的X線照射慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞，WB方法檢測不同時間點Rac1蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)照射前后總的Rac1蛋白表達(dá)量無明顯變化，但隨著時間的延長，Rac1蛋白的表達(dá)量有所減少。由此可推斷Rac1參與了輻射誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的過程。Rac1蛋白表達(dá)的減少可促進(jìn)K562細(xì)胞的凋亡率的增加，抑制Racl蛋白表達(dá)可以促進(jìn)K562細(xì)胞的凋亡。這將為臨床腫瘤放射治療提供新的治療靶點。

參考文獻(xiàn)：

[1]Duran RV，Hall MN.Regulation of TOR by small GTPases.EMBO Rep 2012；13：121-128.

[2]Paulo Matos， Jennifer Skaug； et al. Small GTPase Rac1： Structure， Localizationand Expression of the Human Gene[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2000，277：741-751.

[3]Wang， Qing Rao； et al.Overexpression of Rac1 in leukemia patients and its role in leukemia cell migration and growth[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2009，386 ：769-774.

[4]魏世平，王克猛.結(jié)直腸癌中Racl的表達(dá)研究[J].河北醫(yī)藥，2011，33：3701-3702.

[5]田銳，郭興軍.Racl對胰腺癌增殖的影響及其機(jī)制[J].世界華人消化雜志， 2013，21（12）：1070-1074.

[6]鄢毅權(quán)，李介秋.Racl基因在肝細(xì)胞癌中的過表達(dá)與轉(zhuǎn)移侵襲的關(guān)系[J].醫(yī)學(xué)臨床研究，2007，24（9）：1493-1498.

[7]Jiang P，Enomoto A.Cell biology of the movement of breast cancer cells：intracellular signaling and the actin cytoskeleton [J].Cancer Lett，2009，284（2） ：122-130.

[8]吳況明，蔣良友.Rac1和Pak1在胃癌中的表達(dá)及意義[J].國際病理科學(xué)與臨床雜志，2010，30：469-472.編輯/申磊