耐甲氧西林葡萄球菌常規檢測方法的比較

摘要：目的 比較三種方法對耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的陽性檢出率和特異性，尋找適合實驗室常規檢測耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）簡易，準確的方法。方法 通過頭孢西丁（30μg/片）紙片擴散法、苯唑西林（1μg/片）紙片擴散法和苯唑西林瓊脂篩選法對臨床分離的67株葡萄球菌進行MRS檢測，比較其MRS檢出率，為分析NaCl對頭孢西丁和苯唑西林紙片擴散法檢測結果的影響，同時用含4%NaCl的M-H培養基和普通M-H培養基進行檢測，比較其差異。結果 67株葡萄球菌中瓊脂篩選法檢出率為79.1%；頭孢西丁紙片擴散法在含4%NaCl和普通M-H培養基檢出率相同，均為71.6%，苯唑西林（1μg/片）紙片擴散法在含4%NaCl的M-H培養基檢出率為76.1%，普通M-H培養基檢出率為73.1%，苯唑西林紙片法在含4%NaClM-H培養基上的檢出率高于普通M-H培養基，分別各有1株金葡和凝固酶陰性葡萄球菌未被檢出。結論 頭孢西丁（30μg/片）紙片擴散法與苯唑西林瓊脂篩選法具有很好的相關性，且不受NaCl影響，該法操作簡便易行，各醫院臨床實驗室均能開展，是檢測MRS值得推薦的方法。

關鍵詞：耐甲氧西林葡萄球菌；頭孢西丁紙片擴散法；苯唑西林瓊脂篩選法；mecA基因

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1菌株 2012年3月～11月從本院檢驗科臨床標本分離到的葡萄球菌67株，其中金黃色葡萄球菌（SA）31株，凝固酶陰性葡萄球菌（CNS）36株，保存于-20℃低溫冰箱，實驗前轉種于5%脫纖維羊血培養基備用，參考菌株：ATCC25923為MRS陰性及藥敏試驗質控菌株，ATCC43300為MRS陽性質控菌株。均由云南省臨床檢驗中心提供。

1.1.2試劑和材料 藥敏紙片：頭孢西丁（30μg/片，批號：2001210）、苯唑西林（1μg/片，批號：201209），北京天壇生物技術開發公司生產；苯唑西林標準品，山東瑞陽制藥有限公司生產；批號：12030814；M-H培養基，杭州天和微生物試劑有限公司生產；批號：120422；MRS瓊脂篩選培養基：配制M-H瓊脂培養基（OXAID公司產品；批號：201212），加入NaCl使其濃度達4%，經高壓滅菌，冷卻至50℃時加入苯唑西林，使其最終濃度為6μg/ml，傾注培養基。金葡萄菌乳膠凝集診斷試劑盒Staph Slidex-kit，法國生物梅里埃公司產品，批號：73115。

1.2.方法

1.2.1 菌種鑒定 臨床標本按常規進行分離培養，對所有分離到的葡萄球菌用金葡萄菌乳膠凝集診斷試劑盒Staph Slidex-kit進行鑒定。

1.2.2 菌液制備 按NCCLS標準進行，挑取孵育18～24h的單個菌落以生理鹽水稀釋至0.5麥氏單位比濁標準備用。

1.2.3頭孢西丁（30ug/片）紙片擴散法：取0.5麥氏單位菌液均勻涂布于含4%NaClM-H培養基和普通M-H培養基，貼30μg/片頭孢西丁藥敏紙片35℃24h觀察結果（CNS孵育48h），SA抑菌圈直徑≤21mm，報苯唑西林耐藥，CNS抑菌圈直徑≤24mm，報苯唑西林耐藥。質控菌株為SA ATCC 25923。

1.2.4苯唑西林紙片擴散法 將0.5麥氏單位的菌液均勻涂布于含4%NaClM-H培養基和普通M-H培養基，貼1μg/片苯唑西林藥敏紙片35℃24h觀察結果（CNS孵育48h），SA抑菌圈直徑≤10mm為耐藥，SA抑菌圈直徑在11～12mm為中介，SA抑菌圈直徑≥13為敏感，CNS抑菌圈直徑≤17mm為耐藥，CNS抑菌圈直徑≥18mm為敏感。質控菌株為SA ATCC 25923。

1.2.5 苯唑西林瓊脂篩選法 制備含6μg/ml苯唑西林、4%NaCl的篩選M-H瓊脂培養基，將校正過的0.5麥氏單位菌液點種于上述培養基上，SA35℃孵育24h，CNS48h觀察結果。在此平板上只要有一個菌落生長即判斷為MRS，不生長的為甲氧西林敏感葡萄球菌（MSS）。質控菌株為ATCC 43300。

2結果

2.1 67株葡萄球菌中乳膠凝集實驗凝集有31株，定性為金黃色葡萄球菌。33株葡萄球菌中乳膠凝集實驗陰性，定性為凝固酶陰性葡萄球菌。

2.4 三種方法對MRS的檢出結果比較 從實驗結果看，三種方法對MRS的檢出率具有較高的符合率，分別為頭孢西丁紙片法71.6%、苯唑西林紙片法76.1%（4%NaClM-H），73.1%（普通M-H）、瓊脂篩選法79.1%。其中頭孢西丁紙片法在4%NaClM-H和普通M-H上檢出結果相同。但幾種方法的檢測結果也存在差異，苯唑西林紙片法在含4%NaClM-H培養基上的檢出率高于普通M-H培養基，分別各有1株金葡和凝固酶陰性葡萄球菌未被檢出，此外，在普通M-H培養基上有一例SA抑菌圈直徑處于藥敏判斷中介，無法判斷是否為MRSA。頭孢西丁紙片法比苯唑西林瓊脂篩選法少檢出5株MRS，在含4%NaClM-H培養基上，頭孢西丁紙片法比苯唑西林紙片法少檢出5株MRS，在普通M-H培養基上比苯唑西林紙片法少檢出3株MRS。

3 討論

葡萄球菌對β-內酰胺類抗生素耐藥機理[1]主要有以下幾個方面：①由染色體mecA基因大量表達一種特殊青酶素結合蛋白（PBP2a），這種蛋白存在細胞表面，對β-內酰胺類抗生素具有極低的親和力，使MRSA很少或不能與β-內酰胺類抗生素結合，從而產生耐藥。②產生大量β-內酰胺酶，緩慢水解β-內酰胺抗生素。③細菌產生PBP2a之外的其它過量PBPs。MRSA產生的最主要原因為產生mecA編碼的PBP2a，不利于mecA基因表達的外界條件可使傳統的藥敏試驗出現假陰性[2]，從所做實驗看來，在M-H培養基中加入4%NaCl，孵育溫度35℃，結果頭孢西丁紙片法陽性的48株葡萄球菌在瓊脂篩選法上均顯示耐藥，苯唑西林紙片擴散法陽性的51株葡萄球菌在瓊脂篩選法上也顯示耐藥，并且苯唑西林紙片擴散法在加4%NaClM-H培養基比普通M-H培養基多檢出2例MRSA，還未出現普通M-H培養基SA抑菌圈處于中度敏感，無法判斷結果的情況（普通M-H培養其中有1例SA抑菌圈直徑處于中度敏感）。提示上述條件有利于mecA基因表達，克服葡萄球菌生長不均一的耐藥特點，從而提高表型檢測的敏感性。耐藥的不均一性也是表型檢測造成假陰性的因素[2]。葡萄球菌的耐甲氧西林不均一性和mecA基因轉錄調節因子mecR1、mecI等有關。觀察K-B擴散法時應注意抑菌圈內是否有單個菌落或霧狀生長，凡抑菌圈內出現散在菌落者均視為MRS菌株。就我們所做實驗的觀察而言，加4%NaClM-H培養基藥敏實驗抑菌環明顯小于不含鹽者，易于觀察測量抑菌圈直徑，若不仔細觀察普通培養基易發生假陰性結果。

mecA基因檢測被視為對MRS檢測的一種\"金標準\"，但受設備、儀器試劑、人員素質和費用的限制，不易在各醫院臨床實驗室普遍開展。本文根據NCCLS2013年1月用30ug/片頭孢西丁檢測mecA介導苯唑西林耐藥金黃色葡萄球菌，用頭孢西丁紙片擴散法對67株葡萄球菌與以前推薦常規表型檢測法進行比較評價，結果頭孢西丁紙片擴散法陽性的48株葡萄球菌在苯唑西林瓊脂篩選法上均顯示耐藥，符合率為91%（48/53），說明頭孢西丁紙片擴散法與苯唑西林瓊脂篩選有很好的相關性，并且頭孢西丁紙片擴散法藥敏實驗判斷標準不存在中介結果，克服了苯唑西林紙片擴散法檢測中，葡萄球菌抑菌圈為中介需做苯唑西林MIC來判斷的問題，且該法操作簡便，設備簡單，各級醫院臨床實驗室均能開展，是檢測MRS值得推薦的方法。

本文苯唑西林瓊脂篩選法比頭孢西丁紙片擴散法多檢出5株MRSA，因受條件所限，本次實驗無法運用PCR檢測mecA，所以無法判斷這5株葡萄球菌mecA的存在與否，但根據NCCLS推薦頭孢西丁檢測MRSA的原因：\"用30ug/片頭孢西丁檢測對葡萄球菌做藥敏實驗能預報mecA介導的MRSA耐藥[3]\"，且參考相關論文頭孢西丁紙片擴散法與多重聚合酶鏈反應檢測耐甲氧西林葡萄球菌的mecA符合率為100%，所以推測這5株葡萄球菌可能為mecA陰性，其耐藥原因可能為β-內酰胺酶的大量產生，或存在PBP2a之外的低親和力PBP有關，這5株葡萄球菌對β-內酰胺類抗生素或β-內酰胺類抗生素與β-內酰胺類酶的聯合抑制劑仍然敏感，預示可選用毒副作用比萬古霉素低的其它抗生素。這正是NCCLS推出頭孢西丁檢測MRSA的理由：頭孢西丁代替苯唑西林檢測mecA介導的MRSA，可提高MRS檢測的特異性。從而減少了非mecA基因介導的假MRSA，臨床醫生對這類感染的治療也更有針對性。

參考文獻：

[1] 鄭波，李家泰.多重聚合酶鏈反應檢測耐甲氧西林葡萄球菌[J].中華醫學檢驗雜志，1999；22（3）：145.

[2] 洪秀華，唐毅，毛向群，等.耐甲氧西林葡萄球菌四種方法比較及臨床應用[J].上海醫學檢驗雜志，1999，14（4）203.

[3] 陳民均.美國臨床實驗室標準化委員會2004年版有關藥敏實驗標準化更新要點[J].中華醫學檢驗雜志，2004；27（3）：608.編輯/王海靜