價撥冷沉淀細菌內毒素檢測方法建立

摘要：目的 建立冷沉淀細菌內毒素檢查方法。方法 按《中國藥典》2010年版（二部）附錄收載的細菌內毒素檢查方法及指導原則進行實驗。結果 冷沉淀經過特殊方法溶解后的溶液在原倍下對鱟試劑無干擾作用。結論 細菌內毒素檢測方法可用于冷沉淀的熱原檢查。

關鍵詞：細菌內毒素；冷沉淀；鱟試劑

根據《關于開展價撥凝血因子生產用冷沉淀試點工作的通知》[1]（國食藥監安[2007]748號）可知，冷沉淀對緩解當前凝血因子Ⅷ制劑市場供應短缺局面具有不可或缺的作用，而在目前使用的冷沉淀質量標準中明確規定冷沉淀細菌內毒素含量≤5EU/g 。因此冷沉淀細菌內毒素檢測方法的建立迫在眉睫。

1 儀器與試劑

移液器、DELTA 320型pH計、Scout Pro601F型電子天平、37℃±1℃恒溫水浴箱，無熱原吸頭、螺旋震蕩器。

細菌內毒素工作標準品（CSE，效價100EU/支，批號150601-201176，中國食品藥品檢定研究院），鱟試劑 （TAL1，靈敏度0.25EU/ml，批號1313041，湛江安度斯生物有限公司；TAL2，靈敏度 0.125EU/ml，批號 120201，廈門鱟試劑廠；TAL3，靈敏度0.06EU/ml，批號1301302，湛江安度斯生物有限公司），細菌內毒素檢查用水（批號1211100，含量≤0.03EU/ml，湛江安度斯生物有限公司）。

Tris緩沖液（批號，20130520，自配，采用細菌內毒素檢測用水配置保證無熱原），配制方法：取三羥甲基氨基甲烷0.6004g溶解于裝有100ml細菌內毒素檢查用水的去熱原試劑瓶中，振蕩至完全溶解，再加入細菌內毒素檢查用水至250ml，最后用濃度為1mol/L的鹽酸在pH計上調節pH至7.03。

冷沉淀：C-P12218-2100-1（用作干擾試驗），C-P12220-2100-1，C-P12225-2100-1，C-P12230-2100-1

2 方法與結果

2.1鱟試劑靈敏度復核實驗 按照《中國藥典》[2]2010年版二部附錄XII？E“鱟試劑靈敏度復核試驗”規定的的方法對所使用的鱟試劑進行靈敏度復核試驗。經復核，兩種鱟試劑的的靈敏度的測定值都在0.5λ～2λ，復核規定要求見表1。

2.2冷沉淀溶解 取一定量的冷沉淀（1.0g～3.0g），按照1：9（冷沉淀質量：Tris緩沖液體積）加入無熱原瓶中，37℃水浴，每5min震蕩一次，直到完全溶解或者30min。然后在離心機上3000r/min， 4℃，離心15min。離心完成后蓋上去熱原不銹鋼蓋即為試驗用樣品。

2.3試驗方法 冷沉淀溶解液細菌內毒素限值（L）的確定：L=L0/稀釋倍數，式中質量標準中規定L0≤5EU/g，稀釋倍數為10倍。經計算，因此冷沉淀溶解液細菌內毒素理論限值為：L=L0/稀釋倍數=5/10=0.5EU/ml。供試品的最大有效稀釋倍數（MVD）：例如選用靈敏度為0.25EU/ml鱟試劑時，MVD=L/λb=0.5/0.25=2倍。

2.4供試品干擾試驗 干擾試驗選擇靈敏度為0.25EU/ml，0.125 EU/ml，0.06 EU/ml鱟試劑，冷沉淀的最大有效稀釋倍數分別為2、4、8倍。按下表對各樣品進行稀釋。

將以上的A、B、C、D溶液加入鱟試劑反應管中垂直放入（37±1）℃水浴中，保溫（60±2）min后，取出供試品判定結果（見表3）。

結果判定：只有當溶液A和陰性對照液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結果在鱟試劑靈敏度復核范圍內時，試驗方為有效。按下式計算系列溶液C和B的反應終點濃度的幾何平均值（ES和Et）

式中 Xs、Xt分別為溶液C與B的反應終點濃度的對數值（lg）。ES在0.5λ～2λ間且Et在0.5 ES～2 ES供試品稀釋液在該稀釋倍數倍下對鱟試劑無干擾作用

代入公式計算可得TAL1： ES=λ；Et=0.87λ，TAL2 ：ES=λ；Et=λ；ES=λ；TAL3：Et=λ； ES=0.75λ干擾試驗成立，供試品稀釋液在相對應的最大倍稀釋下對鱟試劑無干擾。

2.5冷沉淀細菌內毒素檢測 取3批冷沉淀（批號為C-P12220-2100-1，C-P12225-2100-1，C-P12230-2100-1），用細菌內毒素檢測用水稀釋4倍，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進行試驗（見表4）。

由表4可見，供試品和陰性對照管均為陰性，陰性對照管和供試品陽性對照管均為陽性， 3個批號供試品的細菌內毒素檢查均符合規定。

3 討論

考慮到冷沉淀其成分比較復雜以及來源和工藝的原因，存在干擾因素較多，故將本品稀釋4倍后，選用靈敏度為0.125 EU/m的鱟試劑時，對實驗不產生干擾。

本次試驗結果證實，細菌內毒素檢測法可以對冷沉淀細菌內毒素進行檢測。

參考文獻：

[1]《關于開展價撥凝血因子生產用冷沉淀試點工作的通知》（國食藥監安[2007]748號）.

[2]中華人民共和國藥典委員會編.中華人民共和國藥典[S].二部.北京：化學工業出版社，2010版.

編輯/蘇小梅