血必凈對膿毒癥大鼠T細(xì)胞凋亡和PD—1/PD—L1表達(dá)的影響

摘要：目的 探討血必凈對膿毒癥T細(xì)胞凋亡和PD-1/PD-L1表達(dá)的影響。方法 選用SD大鼠60只，采用經(jīng)典盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（cecal ligation and puncture， CLP）復(fù)制膿毒癥模型，設(shè)立正常組、假手術(shù)組、CLP模型組、CLP模型加血必凈組4組，CLP模型加血必凈組大鼠于CLP術(shù)后腹腔注射血必凈。流式細(xì)胞儀檢測上述4組小鼠術(shù)后12h、24h、36h及48h胸腺T細(xì)胞凋亡、胸腺T細(xì)胞PD-1和單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)。結(jié)果 胸腺T細(xì)胞凋亡、胸腺T細(xì)胞PD-1和單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)在正常組與假手術(shù)組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），CLP模型組自12h起各時(shí)間點(diǎn)脾淋巴細(xì)胞凋亡水平、胸腺T細(xì)胞PD-1和單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)均較假手術(shù)組明顯升高（P<0.05）。且各時(shí)點(diǎn)CLP模型加血必凈組脾淋巴細(xì)胞凋亡水平、胸腺T細(xì)胞PD-1和單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)均較相應(yīng)時(shí)點(diǎn)CLP組水平下降（P<0.05）。結(jié)論 血必凈可以降低膿毒癥T細(xì)胞凋亡及PD-1/PD-L1表達(dá)。

關(guān)鍵詞：膿毒癥；血必凈；T細(xì)胞凋亡；PD-1/PD-L1

膿毒癥患者后期存在免疫抑制，PD-1是新型免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，PD-1與其配體之一PD-L1結(jié)合可通過負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能參與多種疾病的免疫調(diào)節(jié)。本課題擬探討血必凈對膿毒癥大鼠T細(xì)胞凋亡和PD-1/PD-L1表達(dá)的影響，探討血必凈在膿毒癥免疫抑制期的調(diào)節(jié)作用及可能機(jī)制。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SD大鼠60只，體重180～220g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1～2w，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常組（n=6）、假手術(shù)組（n=6）、模型組（n=24）、血必凈組（n=24）。模型組與血必凈組分別于術(shù)后12h、24h、36h及48h各處死6只并獲取標(biāo)本。

1.2方法 按照大鼠盲腸結(jié)扎穿孔模型（CLP）制作方法制作膿毒血癥模型。模型制作前禁食12h，10%水合氯醛400mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，腹正中切口2cm， 在盲腸根部用4號(hào)線結(jié)扎盲腸，用14G套管針將盲腸貫通穿孔，還納腸管于腹腔，間斷縫合腹壁。術(shù)畢立即皮下注射10 m1生理鹽水抗休克。假手術(shù)組只暴露盲腸后縫合皮膚，經(jīng)陰莖背靜脈注射生理鹽水4 ml/kg。血必凈組在CLP基礎(chǔ)上經(jīng)陰莖背靜脈注入血必凈注射液4 mg/kg。脾淋巴細(xì)胞凋亡采用原位末端凋亡檢測（TUNEL）法。流式細(xì)胞儀檢測胸腺T細(xì)胞PD-1和單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)。FACS Calibur流式細(xì)胞儀系美國BD公司產(chǎn)品；血必凈注射液由天津紅日藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)（國藥準(zhǔn)字Z20040033）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以（x±s）表示，統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析。同一時(shí)點(diǎn)組間比較用 t 檢驗(yàn)，組間比較用q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有非常顯著性。

2結(jié)果

2.1脾TUNEL染色細(xì)胞陽性率比較 對照組與假手術(shù)組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=1.000）。CLP組自12h起各時(shí)間點(diǎn)脾淋巴細(xì)胞凋亡水平均較假手術(shù)組明顯升高（P<0.05）。CLP加血必凈組各時(shí)點(diǎn)脾淋巴細(xì)胞凋亡水平雖亦有所升高，但僅24h組與假手術(shù)組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），且各時(shí)點(diǎn)CLP加血必凈組脾淋巴細(xì)胞凋亡水平均較相應(yīng)時(shí)點(diǎn)CLP組水平下降，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），見表1。

2.2各組動(dòng)物脾組織中CD3+細(xì)胞比例比較 對照組與假手術(shù)組之間脾組織中CD3+細(xì)胞比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.266）。自12h起各時(shí)點(diǎn)膿毒癥組脾組織中CD3+細(xì)胞比例均較假手術(shù)組明顯降低（P<0.05）。中藥組CD3+細(xì)胞比例除12h低于假手術(shù)組外（P<0.05），其余各時(shí)點(diǎn)均與假手術(shù)組無明顯差異。且中藥組s自12h起各時(shí)點(diǎn)膿毒癥組脾組織中CD3+細(xì)胞比例較相應(yīng)時(shí)點(diǎn)膿毒癥組水平升高（P<0.05），見表2。

2.3各組動(dòng)物脾組織中CD3+細(xì)胞PD-1及單核細(xì)胞 PD-L1表達(dá)比較 對照組與假手術(shù)組之間脾組織中CD3+細(xì)胞PD-1/及單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.266）。自12h起各時(shí)點(diǎn)脾組織中CD3+細(xì)胞PD-1/及單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)均較假手術(shù)組明顯降低（P<0.05）。血必凈組脾組織中CD3+細(xì)胞PD-1/及單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)除12h低于假手術(shù)組外（P<0.05），其余各時(shí)點(diǎn)均與假手術(shù)組無明顯差異。且血必凈組自12h起各時(shí)點(diǎn)膿毒癥組脾組織中CD3+細(xì)胞PD-1/ PD-L1表達(dá)較相應(yīng)時(shí)點(diǎn)膿毒癥組水平升高（P<0.05），見表3，表4。

3討論

膿毒癥晚期，機(jī)體表現(xiàn)為免疫抑制，淋巴細(xì)胞大量凋亡導(dǎo)致的淋巴細(xì)胞數(shù)減少可能是造成這一表現(xiàn)的重要因素。Hotchkiss等[1]報(bào)道死于膿毒癥的患者存在明顯的低淋巴細(xì)胞血癥，脾臟和淋巴結(jié)中的淋巴細(xì)胞凋亡明顯增加[2]。 這提示我們，糾正淋巴細(xì)胞的異常凋亡應(yīng)成為治療膿毒癥新的著眼點(diǎn)。

機(jī)體免疫系統(tǒng)存在一群共抑制分子，其主要功能是抑制從中樞免疫耐受機(jī)制中逃逸的自身反應(yīng)細(xì)胞和接受抗原刺激后免疫細(xì)胞的過度反應(yīng)，以維持機(jī)體免疫活化和免疫耐受之間的平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。程序性死亡受體-1（programmed death 1，PD-1）是新型免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，為CD28家族成員，能夠與B7家族分子PD-L1或PD-L2結(jié)合。PD-1可表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞、髓系細(xì)胞和胸腺細(xì)胞。PD-1與其配體之一PD-L1結(jié)合可傳遞負(fù)性調(diào)控信號(hào)，導(dǎo)致病原特異性T細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡和免疫無能。現(xiàn)有研究提示， PD-1/PD-L1途徑在慢性病毒感染、腫瘤免疫、自身免疫性疾病等的免疫調(diào)節(jié)方面有著廣泛的作用[3-7]。

膿毒癥的免疫抑制期與慢性病毒感染、腫瘤、自身免疫性疾病的免疫耐受/抑制，具有一定相似性，本研究結(jié)果表明膿毒癥確實(shí)存在T細(xì)胞凋亡增多的現(xiàn)象， PD-1/PD-L1表達(dá)增高的情況，證實(shí)了這一推測。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為膿毒癥屬\"傷寒\"、\"溫病\"學(xué)的范疇，運(yùn)用傷寒、溫病的理論研究膿毒癥非常合理，這不僅體現(xiàn)在膿毒癥的臨床特點(diǎn)與傷寒、溫病的臨床特點(diǎn)相似，更重要的是兩者之間研究的對象一致。中醫(yī)學(xué)在此類疾病方面積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，整個(gè)中醫(yī)學(xué)的發(fā)展史實(shí)際上就是認(rèn)識(shí)治療感染性疾病即膿毒癥的歷史[8]。中西醫(yī)結(jié)合是治療膿毒癥的重要措施[9]。

血必凈注射液是我國著名中西醫(yī)結(jié)合危重病學(xué)家王今達(dá)教授歷30余年臨床研究，目前已廣泛應(yīng)用于膿毒癥治療的中藥二類新藥（國藥準(zhǔn)字J20040033），主要成分為赤芍、川芎、丹參、紅花和當(dāng)歸等。該藥具有活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)、潰散毒邪的作用，可以拮抗內(nèi)毒素，并抑制內(nèi)源性炎性介質(zhì)（TNF-α）的失控釋放，與抗生素并用治療膿毒癥具有較好的臨床療效[10]。

本次研究表明血必凈可以降低膿毒癥T細(xì)胞凋亡，影響PD-1/PD-L1表達(dá)。說明PD-1/PD-L1可能是血必凈調(diào)節(jié)膿毒癥晚期免疫抑制狀態(tài)，降低T細(xì)胞凋亡的重要靶點(diǎn)。

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編輯/申磊