乙型肝炎患者血清抗黑素細(xì)胞抗體檢測及與白癜風(fēng)發(fā)病相關(guān)性的分析

摘要：目的 檢測乙型肝炎患者血清中抗黑素細(xì)胞抗體水平，對其與乙型肝炎患者并發(fā)白癜風(fēng)的相關(guān)性進(jìn)行分析。方法 收集經(jīng)過乙肝五項(xiàng)檢測的血清標(biāo)本88份，根據(jù)乙肝五項(xiàng)結(jié)果模式分為肝炎組（48例）和非肝炎組（40例），肝炎組標(biāo)本包括HbsAg、HbeAg、HbcAb陽性（大三陽）8例，HbsAg、HbeAb、HbcAb陽性（小三陽）40例，非肝炎組標(biāo)本包括HbsAb、HbeAb、HbcAb三抗體陽性（2，4，5）16例，HbsAb陽性（2）16例，全陰性（-）8例，采用ELISA法檢測抗人黑素細(xì)胞抗體水平，將組間及組內(nèi)標(biāo)本的抗體滴度水平，抗體陽性率進(jìn)行比較，并用SPSS13.0軟件分析，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異非常顯著。結(jié)果 肝炎組大三陽、小三陽抗黑素細(xì)胞抗體陽性率分別為87%（7/8）、85%（34/40），非肝炎組2，4，5陽性、2陽性、全陰性標(biāo)本為0%（0/16）、0%（0/16）、0%（0/8）；肝炎組大三陽、小三陽陽性標(biāo)本抗體OD均值為1.945±0.652、1.834±0.867，非肝炎組標(biāo)本OD均值為0.166±0.068、0.196±0.058、0.263±0.034，經(jīng)比較肝炎組與非肝炎組患者在抗體陽性率和抗體滴度水平上差異非常顯著（P<0.01），肝炎組內(nèi)及非肝炎組內(nèi)患者兩項(xiàng)指標(biāo)差異不顯著（P>0.05）。并發(fā)白癜風(fēng)的乙肝患者高滴度抗黑素細(xì)胞抗體陽性率100%。結(jié)論 大部分乙型肝炎患者血清內(nèi)存在高滴度的抗黑素細(xì)胞抗體，高抗體水平可能和乙肝患者繼發(fā)白癜風(fēng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：乙肝；白癜風(fēng)；抗黑素細(xì)胞抗體；ELISA

白癜風(fēng)是一種局限性或泛發(fā)性色素脫失性皮膚病，臨床上可能和其他器官特異性自身免疫性疾病有關(guān)，如自身免疫甲狀腺炎、自身免疫性多內(nèi)分泌腺綜合征I型及乙型肝炎等[1]。該病病因尚不清楚，包括自身免疫學(xué)說、黑素細(xì)胞自身破壞凋亡學(xué)說、神經(jīng)化學(xué)因子學(xué)說等[2-4]，近年來更多學(xué)者支持白癜風(fēng)的發(fā)病與自身免疫異常有關(guān)，患者體內(nèi)存在細(xì)胞免疫和體液免疫紊亂：前者表現(xiàn)為CD4陽性T細(xì)胞水平下降，CD8陽性T細(xì)胞水平上升，CD4/CD8比值下降[5]，白癜風(fēng)白斑區(qū)邊緣處有大量浸潤的T淋巴細(xì)胞等[6]；后者表現(xiàn)為患者體內(nèi)會有抗黑素細(xì)胞抗體等多種自身抗體出現(xiàn)，而且這些抗體水平可能和白癜風(fēng)的活動性有關(guān)[7]。在本實(shí)驗(yàn)室前期對白癜風(fēng)患者血清抗黑素細(xì)胞抗體的檢測中發(fā)現(xiàn)，擁有高滴度抗體水平的白癜風(fēng)患者均為HbsAg陽性患者，是病例巧合還是普遍規(guī)律尚未明確，國內(nèi)外以往文獻(xiàn)也未發(fā)現(xiàn)有類似報(bào)道，所以本研究留取本院乙肝五項(xiàng)體檢結(jié)果不同模式的血清標(biāo)本88例，其中乙肝患者標(biāo)本48例，9例合并白癜風(fēng)，非乙肝患者標(biāo)本40例，用ELISA法檢測了抗黑素細(xì)胞抗體水平，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1標(biāo)本來源 北京市空軍總醫(yī)院2013年10月中接受\"乙肝五項(xiàng)\"體檢的患者血清，其中乙肝患者標(biāo)本48例，包括HbsAg、HbeAg、HbcAb陽性（大三陽1，3，5）8例，HbsAg、HbeAb、HbcAb陽性（小三陽1，4，5）40例，非乙肝患者標(biāo)本40例，包括HbsAb、HbeAb、HbcAb三抗體陽性（2，4，5）16例，HbsAb陽性（2）16例，全陰性（-）8例，年齡分布在18～55歲。標(biāo)本留取方法為當(dāng)日標(biāo)本檢測完畢后，挑取目標(biāo)血清200μl于無菌ELISA板管中，-20℃保存?zhèn)溆茫?個月內(nèi)完成檢測。

1.2試劑及儀器

1.2.1抗人體黑素細(xì)胞抗體ELISA試劑盒 北京凱諾春天生物試劑有限公司提供，包括標(biāo)準(zhǔn)品6個，樣本稀釋液6ml，HRP標(biāo)記物 10ml，20x洗滌緩沖液25ml，底物A，B各6ml，終止液6ml；

1.2.2冰箱 中國海爾公司生產(chǎn)，SC-316；

1.2.3離心機(jī) 中國河北白洋離心機(jī)廠生產(chǎn)，B600A；

1.2.4 酶標(biāo)儀 美國，Bio-RAD公司；

1.2.5 37℃恒溫箱；

1.2.6全自動洗板機(jī)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 待檢血清室溫自然融化，ELISA試劑盒于室溫平衡30min，洗滌緩沖液按照說明書配制。

1.3.2實(shí)驗(yàn)操作步驟 嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。①設(shè)置樣本孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔分布表（見表1）。②加樣：標(biāo)本區(qū)先加待測樣本10ul，再加樣本稀釋液40ul；標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50ul后每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記物100ul，空白孔不加，封板膜封孔，震動1min，37℃恒溫箱溫育60min。③洗板機(jī)洗板5次。④每孔加入底物A，B各50ul，37℃孵育15min。⑤每孔加入終止液50ul，15min內(nèi)，酶標(biāo)儀450nm波長處測定各孔OD值。陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)本OD值大于全陰性對照組OD均值的2.1倍。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。組間及組內(nèi)陽性率的比較采用÷2檢驗(yàn)，抗體的定量用x±s表示，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異非常顯著。

2結(jié)果

乙型肝炎患者血清抗黑素細(xì)胞抗體OD值和陽性率結(jié)果見表1、圖1。由表中可見乙型肝炎患者組大三陽、小三陽及非乙型肝炎患者組2，4，5陽性、2陽性、全陰性標(biāo)本患者抗體的陽性率分別為87%（7/8）、85%（34/40），0%（0/16）、0%（0/16）、0%（0/8），OD均值為1.945±0.652、1.834±0.867、0.166±0.068、0.196±0.058、0.263±0.034；經(jīng)比較，肝炎組大三陽、小三陽患者標(biāo)本抗黑素細(xì)胞抗體陽性率和吸光度均值明顯高于全陰性對照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異非常顯著（P<0.01）見圖1；非肝炎組2，4，5陽性、2陽性患者標(biāo)本與全陰性對照組比較差異不顯著（P>0.05）。

圖1 肝炎組和全陰性組吸光度值比較

肝炎組內(nèi)大三陽標(biāo)本在抗體陽性率和OD均值上略高于小三陽標(biāo)本，但經(jīng)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）（表2）；肝炎組合并白癜風(fēng)的患者抗黑素細(xì)胞抗體的陽性率為100%（表3）。

3討論

白癜風(fēng)是由于某種原因使位于表皮基底層的黑素細(xì)胞崩解、破潰，局部黑素缺失而出現(xiàn)白斑，臨床易診難治，給患者帶來很大痛苦，發(fā)病率2～3%且近年有增加趨勢。臨床上很多白癜風(fēng)患者合并有其他一些自身免疫病，如乙型肝炎，臨床上有部分乙肝患者患病數(shù)年后會出現(xiàn)白癜風(fēng)的癥狀而且難以控制，我們前期在對136例白癜風(fēng)患者血清抗黑素細(xì)胞抗體的檢測中發(fā)現(xiàn)，擁有高滴度抗黑素細(xì)胞抗體的白癜風(fēng)患者并不多，只有6.6%（9/136）[8]，這些高滴度的患者均為HbsAg陽性，是巧合還是普遍規(guī)律，是乙肝患者并發(fā)白癜風(fēng)之后引起了抗黑素細(xì)胞抗體急劇升高，還是乙肝患者普遍存在高滴度的抗體，這兩種疾病之間在發(fā)病機(jī)制上是否有某種內(nèi)在必然的聯(lián)系目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本文留取了88例乙肝五項(xiàng)不同模式的體檢血清，其中乙肝患者48例，其中包括并發(fā)白癜風(fēng)的9例，非乙肝患者40例，其中8例為無任何皮膚性疾病的全陰性標(biāo)本，用ELISA方法對血清中的抗黑素細(xì)胞抗體進(jìn)行了檢測，結(jié)果大多數(shù)乙肝患者均具有高滴度的抗黑素細(xì)胞抗體，大三陽標(biāo)本陽性率達(dá)87.5%，小三陽為85%，平均為86.25%，非肝炎組2，4，5抗體陽性和2陽性標(biāo)本及全陰性標(biāo)本高滴度抗體陽性率均為0%，乙肝患者組與陰性組陽性率比較有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在抗體檢測OD均值上肝炎組標(biāo)本大三陽略高于小三陽，陽性標(biāo)本OD均值達(dá)陰性對照標(biāo)本均值的7倍以上，而非肝炎組兩種模式的標(biāo)本與全陰性組標(biāo)本比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，甚至出現(xiàn)抗體OD均值低于陰性標(biāo)本現(xiàn)象；另外并發(fā)白癜風(fēng)的乙肝患者血清中高滴度抗體陽性率100%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高滴度的抗黑素細(xì)胞抗體和乙肝病毒的感染及乙肝病毒的活動度密切相關(guān)，而且高滴度的抗體不是在白癜風(fēng)發(fā)生之后出現(xiàn)，而是在發(fā)生前即已在體內(nèi)存在。

白癜風(fēng)的致病機(jī)制尚不明了，目前多數(shù)學(xué)者支持白癜風(fēng)的發(fā)病與患者體內(nèi)自身免疫紊亂有關(guān)，包括體液免疫和細(xì)胞免疫。早年對白癜風(fēng)患者的體液免疫研究指出白癜風(fēng)患者體內(nèi)普遍存在抗黑素細(xì)胞抗體，抗體的滴度與疾病的活動度和類型密切相關(guān)；血清內(nèi)的循環(huán)抗黑素細(xì)胞抗體可以通過補(bǔ)體激活和抗體依賴的細(xì)胞毒作用破壞體外培養(yǎng)的人黑色素細(xì)胞[8]，本文研究結(jié)果顯示絕大部分乙肝患者體內(nèi)存在高滴度的抗黑素細(xì)胞抗體，然而并發(fā)白癜風(fēng)的患者只是個例，筆者認(rèn)為抗黑素細(xì)胞抗體的滴度并非為白癜風(fēng)進(jìn)展程度的反應(yīng)，是否為導(dǎo)致黑素細(xì)胞破壞的直接因素有待于進(jìn)一步研究。

隨著近年來的研究，白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制和乙型肝炎似乎有相似之處。乙肝的發(fā)病并不是HBV感染后直接導(dǎo)致的細(xì)胞毒作用的結(jié)果，而是由T細(xì)胞毒反應(yīng)所介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)誘發(fā)肝臟的免疫病理損傷[9]。目前白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制也更傾向于細(xì)胞免疫反應(yīng)的結(jié)果，CD8+的特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)是自身免疫性白癜風(fēng)發(fā)病的一個重要效應(yīng)機(jī)制[10]，CD8+CTL能夠特異性結(jié)合人正常黑素細(xì)胞表面的MART-1蛋白，通過釋放穿孔素和顆粒酶破壞黑素細(xì)胞。MART-1為人類分化抗原，表達(dá)與幾乎所有黑色素瘤細(xì)胞和黑色素細(xì)胞，而在正常組織卻不表達(dá)，特異性 CTL有識別MART-1的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[11]，所以由此推論，持續(xù)的HBV復(fù)制刺激了機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，CD8+CTL在破壞肝細(xì)胞的同時(shí)，也會破壞人的黑素細(xì)胞，引起部分乙肝患者發(fā)生白癜風(fēng)。至于多數(shù)乙肝患者體內(nèi)產(chǎn)生高滴度的抗黑素細(xì)胞抗體的原因和機(jī)制筆者認(rèn)為可能是黑素細(xì)胞在持續(xù)的細(xì)胞免疫紊亂和攻擊的狀態(tài)下，胞膜或胞漿某些蛋白性質(zhì)改變，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生抗這些蛋白的抗體，抗體滴度的高低更多的是免疫紊亂狀態(tài)的一種指示。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中顯示，少數(shù)乙肝活動期患者抗黑素細(xì)胞抗體陰性的情況，可能是經(jīng)過治療，HBV復(fù)制暫時(shí)停止，細(xì)胞免疫反應(yīng)減弱的結(jié)果。

總之，經(jīng)過本研究，支持白癜風(fēng)的發(fā)生是機(jī)體免疫紊亂的結(jié)果，體內(nèi)高滴度抗黑素細(xì)胞抗體的提示機(jī)體免疫反應(yīng)過強(qiáng)，發(fā)生白癜風(fēng)的可能性增加。

4結(jié)論

①乙肝組與全陰性組抗黑素細(xì)胞抗體滴度和陽性率存在顯著性差異；②非乙肝組與全陰性組抗黑素細(xì)胞抗體滴度和陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；③乙肝患者患白癜風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)增加

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編輯/申磊