液相芯片技術(shù)在國(guó)內(nèi)的發(fā)展現(xiàn)狀

從20世紀(jì)90年代開始生物芯片已在全球進(jìn)行應(yīng)用，其最初用于基因序列分析、基因表達(dá)譜和基因突變體的檢測(cè)等，主要用于基因分析，故又稱為基因芯片或DNA芯片。而隨著其被廣泛應(yīng)用于免疫反應(yīng)、受體結(jié)合等領(lǐng)域，出現(xiàn)了蛋白芯片、細(xì)胞芯片和組織芯片等[1-2]各種生物芯片。

液相芯片是在20世紀(jì)90代中期發(fā)展起來(lái)的，又被稱為xMAP技術(shù)，集流式細(xì)胞技術(shù)、激光、數(shù)字信號(hào)處理系統(tǒng)和傳統(tǒng)化學(xué)技術(shù)為一體的，具有新型通量大、靈活性好，靈敏度高、動(dòng)力學(xué)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。

1原理

1.1 Luminex液相芯片的技術(shù)原理 Luminex液相芯片技術(shù)是基于多種標(biāo)記有不同熒光染料的聚苯乙烯微球，微球直徑一般為5.6 um，微球主要有4種：MicroPlex微球，SeroMap微球、xTAG微球和MagPlex微球。（4種微球原理基本相同，而SeroMap微球是專門為血清學(xué)設(shè)計(jì)的，它可以減少血清中不同抗體與微球的非特異性結(jié)合。在臨床診斷中主要應(yīng)用Luminex液相芯片技術(shù)用于檢測(cè)腫瘤指標(biāo)、細(xì)胞因子及其它一些蛋白質(zhì)物質(zhì)，因此主要是應(yīng)用SeroMap微球進(jìn)行檢測(cè)。）在液相系統(tǒng)中，為了區(qū)分不同的探針，每一種固定有探針的微球都有一個(gè)獨(dú)特的色彩編號(hào)，或稱熒光編碼。不同的顏色微球在激光作用下發(fā)出的熒光均不相同，利用這些微球可以分別標(biāo)記上不同的探針分子。檢測(cè)時(shí)先后加樣品和報(bào)告分子與標(biāo)記微球反應(yīng)，樣品中的目的分子（待檢測(cè)的抗原或抗體）能夠與探針和報(bào)告分子特異性結(jié)合，使交聯(lián)探針的微球攜帶上報(bào)告分子藻紅蛋白，隨后儀器對(duì)微球進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果分析。Luminex檢測(cè)系統(tǒng)采用微流技術(shù)使微球快速單列通過檢測(cè)通道，并使用紅色和綠色兩種激光分別對(duì)單個(gè)微球上的分類熒光和報(bào)告分子上的報(bào)告熒光進(jìn)行檢測(cè)。紅色激光可將微球分類，從而鑒定各個(gè)不同的反應(yīng)類型（即定性）；綠色激光可確定微球上結(jié)合的報(bào)告分子的數(shù)量，從而確定微球結(jié)合的目的分子的數(shù)量（定量）。

1.2液相芯片的技術(shù)優(yōu)勢(shì)

1.2.1高通量、高速度、操作方便 分析熒光速度最高可達(dá)5000～15000個(gè)/s；可對(duì)同一樣本中的多種不同目的分子同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)、定性、定量分析，時(shí)間不到3 h。其孵育時(shí)間比傳統(tǒng)的固相檢測(cè)明顯縮短，而ELISA每孔僅只能對(duì)一種指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，雖有自動(dòng)酶儀，一次也最多只能檢測(cè)幾塊板。采用液相芯片法可以提高檢測(cè)速度。同時(shí)針對(duì)Luminex系統(tǒng)，國(guó)內(nèi)廠家已生產(chǎn)了配套的自動(dòng)加樣儀系統(tǒng)，基本上已實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化檢測(cè)。

1.2.2高靈敏度 液相芯片的微球表面積大于固相表面，固定的包被抗體可達(dá)100000個(gè)。提高了檢測(cè)的靈敏度，檢測(cè)范圍或達(dá)3～5個(gè)數(shù)量級(jí)，最低檢測(cè)濃度可達(dá)0.1 pg/mL。

1.2.3特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好 因?yàn)槭遣捎镁嗝庖邫z測(cè)，與異相免疫相比實(shí)驗(yàn)無(wú)需進(jìn)行洗滌，減少了在操作過程中因洗滌帶的的實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差。在檢測(cè)時(shí)采用了流式激光技術(shù)，在測(cè)定時(shí)是對(duì)每個(gè)微球進(jìn)行檢測(cè)，防止標(biāo)本中的異抗原（抗體）的干擾。

1.2.4標(biāo)本用量小 由于在同一個(gè)反應(yīng)孔中同時(shí)檢測(cè)多種指標(biāo)，與其它方法相比明顯減少了標(biāo)本用量，非常適合稀有標(biāo)本與兒童樣本的檢測(cè)。

2液相芯片技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

液相芯片技術(shù)是迄今為止被美國(guó)食品藥品管理局（FDA）惟一批準(zhǔn)用于臨床診斷的生物芯片技術(shù)。到2005年全球獲得FDA認(rèn)證的液相芯片項(xiàng)目已近200個(gè)。其全球最達(dá)的檢測(cè)平臺(tái)為美國(guó)Luminex公司和荷蘭的QIAGEN跨國(guó)公司。而在美國(guó)Luminex公司生產(chǎn)的Luminex檢測(cè)系統(tǒng)上，目前已有國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的商品化試劑供應(yīng)：比如上海透景公司生產(chǎn)的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)產(chǎn)品、HPV檢測(cè)產(chǎn)品。另外多種研究者根據(jù)研究需要自行制備探針微球交聯(lián)微球，建立反應(yīng)體系對(duì)各種標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。目前液相芯片技術(shù)應(yīng)用主要是用于抗原--抗體反應(yīng)的液相蛋白芯片和用于核酸雜交的液相基因芯片。在國(guó)內(nèi)的應(yīng)用主要涉及以下幾個(gè)領(lǐng)域。

2.1在細(xì)胞因子檢測(cè)方面的應(yīng)用 細(xì)胞因子是T細(xì)胞產(chǎn)生的一大類能在細(xì)胞間傳遞信息、具有免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)功能的蛋白質(zhì)或小分子多肽。因此同時(shí)檢測(cè)多種細(xì)胞因子可以全面判斷機(jī)體免疫功能，在疾病的診斷、病程觀察及療效評(píng)價(jià)方面有重要意義，還能用于研究發(fā)病機(jī)制與藥物作用的機(jī)理。

目前臨床上常用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子，這種方法存在一些局限性：一個(gè)試劑盒僅能檢測(cè)一種因子、檢測(cè)的線性窄，高濃度標(biāo)本需稀釋后才能進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)標(biāo)本用量較大，不利于臨床開展，常用于實(shí)驗(yàn)研究。

吳容等采用液相芯片法檢測(cè)了過敏性紫癜患兒血漿中的IL-2、IFN-r、IL-4水平。在HSP患兒急性期 Th1類細(xì)胞因子IL-2、IFN-r水平降低，Th2類細(xì)胞因子 IL-4水平增高。陳士嶺等采用Luminex液相蛋白芯片檢測(cè)著床窗期子宮內(nèi)膜和早孕蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞因子水平，用Luminex液相蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)了從著床窗期子宮內(nèi)膜到早孕蛻膜表達(dá)15種細(xì)胞因子的變化，發(fā)現(xiàn)其間存在著正相關(guān)、負(fù)相關(guān)或不相關(guān)的關(guān)系。為研究胚胎著床和妊娠建立過程中細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性提供了依據(jù)，提示它們之間可能存在的相互協(xié)同依賴或相互拮抗的關(guān)系。鄧元江[5]等采用液相芯片檢測(cè)了慢性充血性心力衰竭患者血清中細(xì)胞因子TNF-α，IL-6，IL-1β及IL-10的水平，在CHF組中血清TNF-α，IL-6的含量均高于正常對(duì)照組（P<0.05或P<0.01），而IL-10的含量無(wú)明顯變化。王成[6]，駱玉霜[7]等分別采用液相芯片檢測(cè)了青年女性胃癌組織和晚期胃癌患者的ERCC 1、TYMS、TUBB3 mRNA的水平。ERCC1 mRNA低表達(dá)患者使用鉑類藥物效果明顯優(yōu)于ERCC1高表達(dá)者。TUBB3 編碼的β-Tubulin-Ⅲ（3型β微管蛋白）與抗微管化療藥敏感性的關(guān)系最密切。低TUBB3表達(dá)水平的腫瘤患者接受紫杉醇類化療的效果較好，中位生存期較長(zhǎng)。反之，TUBB3高表達(dá)的患者的抗微管類化療藥物療效較差。TYMS（thymidylate synthetase）基因編碼的胸苷酸合成酶（TS）是嘧啶核苷酸合成的限速酶，是腫瘤生長(zhǎng)的重要因子。低TYMS mRNA水平的腫瘤患者接受氟類化療的效果較好，中位生存期較長(zhǎng)。李凱軍[8]、鄭璐玉[9]和王爽[10]等分別檢測(cè)了淚液、痰濕體質(zhì)人群和重癥手足口病患兒血清中的細(xì)胞因子。顯示細(xì)胞因子與各種疾病有密切關(guān)系。中山大學(xué)的王敏儀碩士采用液相芯片技術(shù)檢測(cè)超排卵患者卵泡液中細(xì)胞因子水平。由于細(xì)胞因子檢測(cè)往往需要幾種因子一起測(cè)定，同時(shí)其含量比較低級(jí)，而采用液相芯片技術(shù)檢測(cè)可很好的解決這一問題，上面的研究顯示液相芯片技術(shù)已成為當(dāng)前檢測(cè)細(xì)胞因子主流技術(shù)。

2.2在腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方面的應(yīng)用 腫瘤標(biāo)志物（Tumor Marker）是反映腫瘤存在的化學(xué)類物質(zhì)。它們或不存在于正常成人組織而僅見于胚胎組織，或在腫瘤組織中的含量大大超過在正常組織里的含量，它們的存在或量變可以提示腫瘤的性質(zhì)，借以了解腫瘤的組織發(fā)生、細(xì)胞分化、細(xì)胞功能，以幫助腫瘤的診斷、分類、預(yù)后判斷以及治療指導(dǎo)。目前臨床上檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物主要用于腫瘤的早期診斷、治療、監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷。而現(xiàn)在常用的血清腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)主要采用放射免疫分析、ELISA及最近十幾年開展起來(lái)的化學(xué)發(fā)光與時(shí)間分辨熒光技術(shù)等，但這些方法存在缺陷，①由于采用的是異相免疫測(cè)定，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定的誤差，②每次實(shí)驗(yàn)僅能檢測(cè)一種腫瘤標(biāo)志物。而液相芯片的出現(xiàn)可以彌補(bǔ)這方面的缺陷。但其與化學(xué)發(fā)光相比自動(dòng)化程度有待提高。

梁惠儀，彭娟，李明[11]等采用液體芯片技術(shù)測(cè)定人體血清CEA、AFP、NSE和tPSA，其建立的人血清CEA+AFP+tPSA+NSE的液相芯片檢測(cè)方法，可在2～3 h內(nèi)聯(lián)合定量測(cè)定1～2 uL人血清中的CEA、AFP、NSE、tPSA水平，該方法操作簡(jiǎn)單、快速、靈活、靈敏度高（達(dá)到pg級(jí)）、重復(fù)性好（CV<14%）、檢測(cè)范圍廣（3～5個(gè)數(shù)量級(jí)），與采用CLIA方法所測(cè)得值的相關(guān)性良好。在血清腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)方面還有：彭娟、陳瑋、陳瑋、楊洋等分別對(duì)采用液相芯片技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)人血清CEA、AFP和NSE、聯(lián)合測(cè)定人血清CEA、AFP和tPSA、聯(lián)合測(cè)定人血清CEA、AFP和HBsAg及甲胎蛋白的液相芯片法檢測(cè)等進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示采用液相芯片技術(shù)在檢測(cè)血清腫瘤標(biāo)志物方面具有快速（2～3 h）、靈敏度好、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)；與化學(xué)發(fā)光法相比具有良好的相關(guān)性。和化學(xué)發(fā)光法一樣成為臨床檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的常規(guī)方法。

在其他腫瘤應(yīng)用方面：婁加陶[12]、鄭召玲[13]、劉曉燕與胡搖沁[14]、鄧小梅等分別采用液相芯片技術(shù)檢測(cè)了肺癌、婦科腫瘤、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、宮頸癌中相關(guān)的癌基因。同時(shí)采用液相芯片技術(shù)對(duì)腫瘤用藥的檢測(cè)提供了支撐。

2.3在病原體檢測(cè)方面的應(yīng)用 在病原體的檢測(cè)方面國(guó)內(nèi)主要采用液相芯片法檢測(cè)細(xì)菌的耐藥基因如王清[15]和夏成靜等分別建立了采用液相芯片快速檢測(cè)結(jié)核耐藥基因和常見細(xì)菌大環(huán)內(nèi)酯類和β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因的方法。周林甫等采用液相芯片技術(shù)檢測(cè)了隱球菌性與病毒性腦炎患者腦脊液中相關(guān)細(xì)胞因子，為臨床治療提供方向。江蘇大學(xué)朱虹碩士與廣東醫(yī)學(xué)院夏成靜碩士分別采用液相芯片技術(shù)研究了幽門螺桿菌相關(guān)蛋白基因與臨床常見細(xì)菌大環(huán)內(nèi)酯類和β內(nèi)酰胺酶類耐藥基因。為臨床的藥物治療提供一種新的檢測(cè)方法，為臨床的苛養(yǎng)菌的藥物敏感試驗(yàn)提供了一種新的方法。

在病毒感染的疾病方面：汪毅、劉利軍、劉紅艷等采用液相芯片技術(shù)分別檢測(cè)了乙肝DNA、抗體和HBV變異株，分別從蛋白質(zhì)和核酸水平對(duì)乙型肝炎病毒進(jìn)行了檢測(cè)；而羅光成[16]等采用液相芯片技術(shù)檢測(cè)了乙型肝炎患者體內(nèi)的細(xì)胞因子與疾患的關(guān)系。鄧小梅、劉思瑤[17]、劉敏等采用液相芯片法對(duì)HPV病毒感染的疾病進(jìn)行了相關(guān)檢測(cè)，為預(yù)防宮頸癌的發(fā)生提供了一種早期診斷依據(jù)。針對(duì)新型病毒領(lǐng)域，液相芯片技術(shù)的應(yīng)用也有報(bào)道，如夏駿等采用液相芯片技術(shù)設(shè)計(jì)針對(duì)禽流感病毒H5N1亞型的檢測(cè)方法。隨著相關(guān)研究的不斷開展，在病原學(xué)方面用以前檢測(cè)手段不能進(jìn)行檢測(cè)的領(lǐng)域，現(xiàn)在采用液相芯片技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)均可取得令人較滿意的結(jié)果。

2.4在基因檢測(cè)方面的應(yīng)用 自從人類基因組工程研究以來(lái)，各種由于基因突變引起疾病越來(lái)越引起人們的注意。而由于單個(gè)核苷酸改變引起DNA序列的多態(tài)性是人類遺傳變異中最常見的一種，特別是隨著生態(tài)污染的加重，這種生物突變更是成為一種常態(tài)。因此單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）的檢測(cè)已經(jīng)成為一個(gè)熱門的研究課題。

常用的技術(shù)手段包括：DNA分子雜交、引物延伸、等位基因特異的寡核苷酸連接反應(yīng)、側(cè)翼探針切割反應(yīng)以及基于這些方法的變通技術(shù)，這些方法檢測(cè)都比較繁煩，實(shí)驗(yàn)中的誤差比較大，不能作為常規(guī)使用。而液相芯片技術(shù)的出現(xiàn)，只需要在擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物采用液相芯片進(jìn)行分析即可，實(shí)驗(yàn)變得簡(jiǎn)單，易掌握、結(jié)果穩(wěn)定可靠。在國(guó)內(nèi)有多人，從各個(gè)方向?qū)Υ诉M(jìn)行了研究：鄭麗霞[18]等采用液相芯片技術(shù)檢測(cè)了非小細(xì)胞肺癌患者的EGFR基因突變，發(fā)現(xiàn)采用液相芯片法相對(duì)于原先的PAGE銀染顯色，自動(dòng)化程度顯著提高，檢測(cè)過程只需要約30 rain，可同步檢測(cè)占90%以上的EGFR基因2種關(guān)鍵突變類型，靈敏度可達(dá)10個(gè)拷貝（0.1%），接近EGFR基因突變的檢測(cè)極限0.05%。王歡、俞永康[19]、劉思瑤、汪棟、孫凱、袁定芬等分別從男性不育、食管鱗癌、非小細(xì)胞癌、尖銳濕疣等方面采用液相芯片技術(shù)對(duì)相關(guān)基因突變進(jìn)行了研究。婁加陶[20]等則詳細(xì)研究了液態(tài)芯片與PCR-LDR對(duì)K-ras基因分型的關(guān)系；作者通過研究發(fā)現(xiàn)液相芯片技術(shù)檢測(cè)靈敏度為10%～20%，高于傳統(tǒng)測(cè)序法的1%。平均CV值<1%，表現(xiàn)出很好的重復(fù)性。從100例NSCLC患者組織樣本中共檢出5例突變，其中3例為Glyl2Val突變，2例為Glyl2Asp突變。而鐘鍵等通過采用液相芯片法檢測(cè)人HLA相關(guān)基因從而為腎移植術(shù)后監(jiān)測(cè)提供了依據(jù)。

除了上述應(yīng)用以外，液相芯片技術(shù)還可用于激素、炎癥因子中醫(yī)癥型[21]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病、及自身抗體、研究酶/底物與分析蛋白表達(dá)等方面。

3結(jié)論

近年來(lái)，液相芯片技術(shù)作為一種新檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展迅速。液態(tài)芯片以其高通量、準(zhǔn)確、快速、靈敏、特異性、多重檢測(cè)、操作簡(jiǎn)便等顯著性優(yōu)點(diǎn)成為一種新型的大規(guī)模生物檢測(cè)平臺(tái)。特別是Luminex系統(tǒng)，現(xiàn)在已有國(guó)產(chǎn)化商品試劑；同時(shí)研發(fā)、配備了自動(dòng)化的加樣、孵育平臺(tái)，使實(shí)驗(yàn)更加自動(dòng)化、結(jié)果更準(zhǔn)確。但與化學(xué)發(fā)光比，每批標(biāo)本均需定標(biāo)是其明顯缺陷，而隨著商品化試劑的開發(fā)，同時(shí)其樣品處理平臺(tái)的進(jìn)一步完善，可以逐步改變這種狀況，使其成為一種常規(guī)使用的高效、高質(zhì)和廉價(jià)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)平臺(tái)，具有廣闊的發(fā)展及應(yīng)用前景。

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編輯/肖慧