殼聚糖—聚乳酸阿霉素膠團的制備及含量測定

摘要：目的 合成并考察殼寡糖-聚乳酸嫁接物及其膠團的理化性質，熒光測定阿霉素膠團的載藥量。方法 采用纖維素酶對殼聚糖進行降解，制備低分子量殼聚糖、殼寡糖。以碳二亞胺為交聯偶合劑合成殼寡糖-聚乳酸聚合物，超聲分散法制備嫁接物膠團；微粒粒度及表面電位儀測定其粒徑和表面電位；以阿霉素為模型藥物，考察膠團對藥物的增溶能力、藥物包封率、載藥量。結果 在殼寡糖-聚乳酸嫁接物中，殼寡糖分子量為20000、聚乳酸分子量為5000的嫁接物平均粒徑最小，藥物包封率最高；聚乳酸分子量為5000殼寡糖-聚乳酸嫁接物載藥膠團載藥量較高。結論 殼寡糖-聚乳酸聚合物膠團是一種良好的抗腫瘤藥物載體，本方法可用于阿霉素膠團中阿霉素的含量測定

關鍵詞：阿霉素；聚合物膠團；藥物載體

在藥劑學領域中，具有病灶組織、細胞靶向控釋給藥系統[1]可提高藥物的穩定性以及藥物的生物利用度，是當前的熱點研究之一；通過藥物載體材料的被動靶向與在此基礎上的主動靶向配體修飾技術，可實現藥物的靶向治療，在最大限度提高藥物本身療效的同時，減少因藥物分子在體內的非靶向分布所造成的毒副作用。聚合物膠團[2]作為一種藥物傳輸系統，可以控制藥物在生物體內的釋放；可穿過血腦屏障、網狀內皮組織系統，達到被動靶向的目的；聚合物膠團骨架對藥物的保護和屏蔽作用，可在一定程度上避免藥物的分解，保持藥物的穩定性，降低藥物的毒性；與脂質體相比，聚合物膠團的載藥量較高；聚合物材料的多樣性，使得以聚合物為載體的藥物制劑亦多樣化，能滿足各種使用需求。

殼聚糖[3]是一類由氨基葡萄糖組成的陽離子聚合物，具有很好的生物相容性、低毒性和可生物降解性，廣泛應用于藥物載體材料的研究。但由于殼聚糖的高分子量，高粘性以及在生理pH條件下不溶等這些缺點，增加了殼聚糖微粒和納米粒的制備難度，以及限制了疏水改性殼聚糖膠團的應用。聚乳酸（ PLA）是一種無毒，可生物降解的聚合物[4-5]， 具有很好的生物相容性，是美國食品和藥物管理局（ FDA）認可的一類生物醫用材料。作為疏水材料可與親水性的材料合成的嵌段共聚物。

本研究通過殼寡糖的氨基與聚乳酸的羧基之間的偶合反應合成殼寡糖-聚乳酸嫁接物，并以超聲分散法制備殼寡糖-聚乳酸嫁接物膠團；研究不同分子量殼寡糖和不同分子量的聚乳酸的殼寡糖-聚乳酸嫁接物膠團的粒徑、粒徑分布、表面Zeta電位、臨界膠團濃度等理化性質；以親脂性抗腫瘤藥物阿霉素為模型藥物，考察嫁接物膠團的藥物增容能力、藥物包封率、載藥量。

1 資料與方法

1.1儀器 電子天平（JA2003，上海楚定分析儀器有限公司），超濾離心管（Microcon YM-10，MWCO 10，000，Millipore Co.，USA），透析袋（MWCO 3500da， Spectrum Laboratories， Laguna Hills， CA），高效液相色譜儀（Agilent 1260， USA），微粒粒度與表面電位測定儀（3000HS， Malvern Co.， UK），熒光分光光度計（F-4600，HITACHI Co.， Japan），冷凍干燥機（FD-1D-50，北京博醫康實驗儀器有限公司），低速離心機（BK-TDZ4-WS，濟南鑫貝西生物技術有限公司），超聲波細胞粉碎機（JY98-ⅢDN，寧波新芝科器研究所）

1.2材料 殼聚糖（分子量450 KDa，95 %脫乙酰度，浙江玉環海洋生物化學有限公司），纖維素酶（CP Power，中國科技開發研究院浙江分院），碳二亞胺（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide， EDC， Sigma Chem.Co， St.Louis， MO USA），芘（Aldrich Chem.Co.，USA），端羧基聚乳酸（分子量5000，10000；山東省醫療器械研究所），鹽酸阿霉素（Adriamycin.HCl，Adr，浙江海正藥業股份有限公司），其它溶劑或試劑均為分析純。

1.3方法

1.3.1殼寡糖的制備 稱取殼聚糖25g倒入燒杯，加750ml水和9.4ml鹽酸，在55℃下攪拌溶脹2h后，加入1.25g殼聚糖酶，控制攪拌速度、反應溫度和時間制備不同分子量的低分子量殼聚糖（殼寡糖）。待反應結束后，加入5 %活性炭，80℃條件下攪拌30min，使酶失活，冷卻至室溫后，4000r·min-1離心10min，分離活性炭，上清液用微孔濾膜處理完全除去活性炭后，噴霧干燥，即得殼寡糖，密封低溫保存備用。

1.3.2殼寡糖分子量測定 本研究采用凝膠滲透色譜法（GPC）測定殼寡糖的分子量。

凝膠滲透色譜條件：色譜柱：TSK-gel G3000 SW；流動相：0.1 M 醋酸鈉（用醋酸調pH至6.0）；柱溫：25 ℃；檢測器溫度：35 ℃；進樣量：10μl；流速：0.8 ml·min-1。以分子量為0.73，5.9，11.8，47.3，212.0，788.0 Kda的葡聚糖標樣制備標準曲線，用該標準曲線計算殼寡糖分子量。

1.3.3殼寡糖-聚乳酸嫁接物（CSO-PLA）的合成 取0.1g殼寡糖，精密稱定，加2ml純水溶解，水浴恒溫在80℃。另稱取適量聚乳酸溶于20mlDMF中。將上述兩溶液混合后，80℃恒溫。稱取EDC適量溶于適量純水中，以一定的時間間隔在80℃的殼寡糖聚乳酸混合溶液中加入定量的EDC水溶液。以開始加入EDC水溶液的時間作為嫁接反應的開始時間，在400r·min-1的磁力攪拌條件下反應6h。反應結束，反應液經冷卻后，將反應液置于透析袋中（MWCO 3500 Da， Spectrum Laboratories， Laguna Hills， CA）透析48h，以除去水溶性副產物，然后將透析液冷凍干燥。通過控制反應物的分子量及投料比，制備各種不同殼寡糖分子量和聚乳酸分子量的的殼寡糖-聚乳酸嫁接物，備用。

1.3.4嫁接物膠團的制備 取10mg嫁接物精密稱定，溶解于5ml蒸餾水，探頭超聲20次（400w，工作2s停3s），用蒸餾水定容至10ml，得到1mg·ml-1的膠團溶液。

1.3.5嫁接物膠團的理化性質評價

1.3.5.1嫁接物膠團粒徑與表面電位測定 制備嫁接物濃度為1mg·ml-1的嫁接物膠團溶液（方法同2.4），以微粒粒度與表面電位測定儀分別測定嫁接物膠團的粒徑與表面電位。

1.3.5.2 嫁接物膠團對阿霉素的增溶能力的考察 分別配制濃度為1 mg·ml-1的嫁接物膠團溶液20ml置釋放管中，加入5mg左右的藥物，在37℃、振蕩頻率為60 r·min-1條件下進行。分別在1h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、72h取樣。離心除去未增溶的藥物（10000 r·min-1，10 min），取上清液0.2ml，加入0.8ml甲醇，以甲醇：水=4：1（v：v）溶液稀釋至適當濃度測定其熒光強度，測定嫁接物膠團的增溶能力。

1.3.6阿霉素載藥膠團的制備 取阿霉素 5mg溶于10mlDMSO中。取10mg嫁接物，精密稱定，加入10ml蒸餾水，探頭超聲20次（400W，工作2s停3s），用蒸餾水定容至10ml，得1 mg·ml-1的嫁接物膠團溶液。

移取嫁接物膠團溶液5ml，加入5ml阿霉素DMSO溶液，置于透析袋（MWCO 3500 Da， Spectrum Laboratories， Laguna Hills， CA）中，外相為1L純水，在磁力攪拌條件下透析6h。離心除去未增溶的藥物（4000 r·min-1，10 min），得到嫁接物載藥膠團溶液。

1.3.7嫁接物載藥膠團粒徑與表面電位測定 取嫁接物載藥膠團溶液適量，以微粒粒度與表面電位測定儀分別測定嫁接物載藥膠團的粒徑與表面電位。

1.3.8嫁接物載藥膠團的藥物包封率、載藥量。

1.3.8.1 阿霉素的含量測定 采用熒光分光光度法測定阿霉素的含量。

采用逐步稀釋法制備藥物在純水、甲醇：水=4：1（v：v）和pH=7.4的PBS三種溶劑中的標準曲線。激發波長為471 nm，發射波長為558 nm。激發狹寬和發射狹寬設置為5 nm。

1.3.8.2嫁接物載藥膠團的藥物包封率、載藥量測定 采用超濾離心法考察嫁接物載藥膠團的藥物包封率。取0.5mg·ml-1的載藥膠團溶液0.2ml，加入0.8ml甲醇，破壞膠團后，以甲醇：水=4：1（v：v）溶液稀釋至適當濃度，用熒光分光光度法測定藥物總濃度（Co）。另移取載藥膠團溶液0.2 ml，置0.4 ml超濾離心管中（Microcon YM-10，MWCO 10，000，Millipore Co.，USA），10，000 r·min-1的速度離心10min，以純水稀釋至適當濃度，用熒光分光光度法測定濾液中游離藥物濃度（C）。按（2.1）式和（2.2）式分別計算藥物包封率和載藥量。藥物濃度Co和C的單位為μg·ml-1。

包封率（%）=（Co-C）/ Co ×100% （2.1）

載藥量（%）=（Co-C）/（500+Co-C） ×100% （2.2）

2 結果

2.1殼聚糖的水解 本研究采用纖維素酶對殼聚糖進行降解制備得到的殼寡糖的重均分子量分別為8000、14000、20000 Da。

2.2殼寡糖-聚乳酸嫁接物的制備 本研究通過使用不同分子量的殼寡糖（重均分子量8000、14000、20000Da）與不同分子量的聚乳酸（分子量為5000，10000），以殼寡糖上的氨基與聚乳酸的羧基之間的偶合反應，制備了投料比不同的不同殼寡糖分子量和聚乳酸的殼寡糖-聚乳酸嫁接物。反應物的分子量，產量和產率及溶解性見表1。

2.3 殼寡糖-聚乳酸嫁接物膠團的理化性質

2.3.1嫁接物膠團粒徑與表面電位測定 由2.2，選擇水溶性好的四種嫁接物。取10 mg CSO-PLA嫁接物，精密稱定，溶解于5ml蒸餾水，探頭超聲20次（400W，工作2s停3s），定容至10ml，得到1 mg·ml-1的膠團溶液。

2.3.2嫁接物膠團對阿霉素堿基的增溶能力的考察 阿霉素堿基在PBS中的溶解度約為3μg·ml-1。為考察殼寡糖-聚乳酸嫁接物的藥物負載能力，本研究采用共孵育法測定了藥物在CSO（14000）-PLA（10000）嫁接物中的溶解度。其結果為36.6μg·ml-1，為在PBS中溶解度的12倍。

2.4 CSO-PLA載藥膠團的粒徑與表面電位 本研究采用0.5mg·ml-1的嫁接物膠團溶度，進行阿霉素堿基的載藥實驗。以嫁接物膠團的粒徑與表面電位以及嫁接物載藥膠團的粒徑與表面電位結果見表2。

2.5 CSO-PLA載藥膠團的藥物包封率以及體外釋放

2.5.1 阿霉素的含量測定 本實驗采用熒光分光光度法測定阿霉素的濃度，將熒光強度I與阿霉素的濃度C（ng·ml-1）進行回歸，采用逐步稀釋法得到藥物在純水、甲醇：水=4：1（v：v）和pH=7.4的PBS中熒光強度I對阿霉素的濃度C的標準曲線，三條標準曲線分別為Y=0.3307X+0.2749，R2=0.9996（阿霉素范圍10～5000 ng·ml-1） 、Y=0.5138X+34.506，R2=0.9993（阿霉素范圍10～5000 ng·ml-1）和Y=0.0.3722X+10.779，R2=0.9996（阿霉素范圍10～1000 ng·ml-1）有很好的線性相關性。

2.5.2 阿霉素載藥膠團的包封率測定 采用超濾離心法測定的阿霉素在藥膠團的藥物包封率結果見表3。

3 討論

殼寡糖有兩個活性基團可以用于化學嫁接，一個是脫去乙酰基位點上的氨基，另一個是殼寡糖鏈上的羥基。通過嫁接反應可以將多肽、羧基等引入到殼寡糖上，賦予殼寡糖新的性能[6]。本實驗中的反應主要通過殼寡糖主鏈上的氨基與聚乳酸上的羧基形成酰胺鍵而達到修飾殼寡糖的目的。殼寡糖-聚乳酸嫁接物（CSO-PLA）的長鏈上既保持了親水性的氨基，又增添了疏水性的烷基鏈，具有兩親性，在水性環境中，其疏水基將自動躲避溶劑以降低自由能，形成疏水基聚集的內核；親水鏈分散于外層，形成親水性外殼。通過微粒粒度與表面電位儀測得CSO-PLA膠團的粒徑和表面電位。當殼寡糖的分子量相同時，隨著聚乳酸分子量的增加，嫁接物分子變大，所以膠團粒徑變大。同時其表面電位變化不大。

殼聚糖化學結構中含有大量氨基，本身帶正電荷。部分氨基被烷基取代后的聚合物，仍然保留了相當數量的氨基，所形成的膠團，其表面電位仍為正值。當聚乳酸的分子量為10000時，隨著殼寡糖分子量的增大，由于嫁接物分子變大，使得膠團粒徑變大。但當聚乳酸的分子量為5000時，隨著殼寡糖分子量的增大，膠團粒徑反而變小，其原因有待進一步研究。產物中CSO（20000）-PLA（5000）粒徑最小。CSO-PLA載藥膠團的粒徑較載藥前都大大減小，這說明大量藥物已經進入膠團的疏水性內核后，膠團分子中的疏水性鏈段與親脂藥物之間的疏水性相互作用增加了膠團的聚合能力，從而使膠團體積減小。

當聚乳酸的分子量一定時，隨著殼寡糖分子量的增加，其包封率和載藥量有所提高。

由化學嫁接得到的兩親性殼寡糖-聚乳酸聚合物，在水性環境中可自發形成膠團。這種聚合物膠團具有比較低的臨界聚集濃度和較小的粒徑。以抗腫瘤藥物阿霉素為模型藥物，發現該聚合物可以作為疏水性藥物的儲庫，具有一定的載藥能力。

參考文獻：

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[2]許鴦雁，牛泱平.聚合物膠團在腫瘤治療中的應用[J].現代醫藥衛生，2010，26（17）.

[3]林水森，李明春，辛梅華，等.殼聚糖及其衍生物抗菌機理研究進展[J].化學通報，2014（3）：220-226.

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[5]馬強，楊青芳，姚軍燕.聚乳酸的合成研究[J].高分子材料科學與工程，2004，20（3）34-35.

[6]LI Y H，HU F Q，YUAN H.Preparation and release profiles of chitosan oligosaccharide grafted stearic acid nanoparticles in vitro[J].Chinese Pharmaceutical Journal，2005，40（14）：1083.

編輯/哈濤