液相色譜實驗教學(xué)設(shè)計

[摘 要]根據(jù)高壓液相色譜（HPLC）分離基本原理以及分子結(jié)構(gòu)相似的有機(jī)物在反相色譜柱的保留時間與其正辛醇-水分配系數(shù)（Kow）直接的對數(shù)線性相關(guān)關(guān)系，可以設(shè)計一套液相色譜實驗教學(xué)方案。與傳統(tǒng)的HPLC教學(xué)實驗方案設(shè)計不同，本方案重點在于讓學(xué)習(xí)者從本質(zhì)上掌握液相色譜分離的基本原理和有機(jī)物的保留規(guī)律。

[關(guān)鍵詞]高壓液相色譜（HPLC） 正辛醇-水分配系數(shù)（Kow） 相關(guān)性分析 實驗設(shè)計

[中圖分類號] G642.423 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-3437（2014）17-0160-03

液相色譜分析是儀器分析的重要手段之一，在現(xiàn)代有機(jī)物分析中發(fā)揮了巨大的作用。液相色譜分析教學(xué)也成為大學(xué)化學(xué)、生物、藥學(xué)、環(huán)境科學(xué)、食品科學(xué)等諸多專業(yè)的《儀器分析》課程中的重要內(nèi)容。隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，各普通高校相關(guān)專業(yè)的實驗條件得到改善，在《儀器分析》配套實驗課程中逐步開設(shè)了高壓液相色譜（HPLC）實驗，有的甚至在專門的《色譜》課程配套實驗中分不同類型、目的多方案開設(shè)實驗。傳統(tǒng)的HPLC教學(xué)實驗常常選擇一種到三種有機(jī)物作為對象，在一定色譜條件下進(jìn)行色譜分離與定性定量檢測，評估分離與分析的性能。然而，多年的教學(xué)經(jīng)驗讓我們發(fā)現(xiàn)一個問題，學(xué)習(xí)過的學(xué)生甚至高年級的研究生并不能初步判斷不同有機(jī)物在反相HPLC上的保留特性的差異，而且往往對色譜分離原理在HPLC的實現(xiàn)機(jī)制缺少應(yīng)有的基本認(rèn)知。這促使我們設(shè)計了一套新的液相色譜實驗教學(xué)，即雙酚類有機(jī)物的Kow測定。

一、實驗原理

色譜法是一種借助色譜分離原理而使混合物中各組分分離的技術(shù)，它是混合物非常有效的分離、分析方法。其中的一相固定不動，稱為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動相。當(dāng)流動相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動相的移動，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時間不同，從而按一定次序由固定相中流出。圖1給出了HPLC的基本組成與結(jié)構(gòu)。

①流動相儲液瓶；②溶劑脫氣機(jī)；③梯度閥；④混合器；⑤高壓泵；⑥六通閥；⑦定量環(huán)；⑧保護(hù)住；⑨色譜柱；⑩紫外檢測器；{11}數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)；{12}廢液收集瓶。[1]

待測有機(jī)組分在固定相和流動相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時的濃度（單位：g / mL）比，稱為分配系數(shù)，用K表示，即：

分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。常用的分配系數(shù)是正辛醇-水分配系數(shù)Kow，即：

式中：CO、CW分別為有機(jī)物在正辛醇相和水相中的平衡濃度。Kow不同，保留時間亦不同。現(xiàn)已積累了大量有機(jī)化合物的Kow值，是量化表征有機(jī)化合物疏水性的方法之一。[2]

USEPA根據(jù)Kow與色譜保留時間t的對數(shù)線性相關(guān)性[如方程（3）所示]，建立了基于反相HPLC保留時間t測定有機(jī)物Kow的標(biāo)準(zhǔn)方法。[3]

log Kow= a log t + b （3）

該標(biāo)準(zhǔn)方法中高效液相色譜法采用C-18反相色譜柱，流動相為甲醇-水混合液。本實驗采用高效液相色譜法測定雙酚類一系列結(jié)構(gòu)相似的有機(jī)化合物的保留時間，通過考察保留時間與Kow之間的關(guān)系來進(jìn)一步理解色譜法的原理，掌握基本實驗操作和數(shù)據(jù)分析方法。本實驗設(shè)計中選擇的系列有機(jī)物是雙酚類有機(jī)物，包括七種，其結(jié)構(gòu)與名稱如圖2所示。

二、實驗試劑及儀器

雙酚類有機(jī)物BPA、TDP、BPAP、BPCH、BPP、TMBPA、BPC的稀溶液；高效液相色譜儀：安捷倫1200（低壓四元梯度HPLC系統(tǒng)的組成見圖1），壓力：200kg / cm2；流速：1.0mL / min；二極管陣列紫外檢測器；色譜柱：Kromasil 100-5C18，150×4.6mm。流動相甲醇-水混合液（80%甲醇∶20%水），20微升定量環(huán)。也可采用手動進(jìn)樣模式的HPLC。

三、實驗步驟

1.按體積比配制80%的甲醇溶液，超聲20min除去溶液中溶解的氣體，用微孔濾膜過濾后即可作為流動相使用。

2.打開高效液相色譜儀，設(shè)置儀器參數(shù)：流速=1mL / min；檢測波長λ=280nm；在工作站中設(shè)置樣品的相關(guān)參數(shù)：樣品名稱、檢測時間、文件指定的保存目錄等。參數(shù)設(shè)好以后開泵脫氣（每次更換新的流動相都要進(jìn)行脫氣操作），脫氣完畢后測試基線。

3.待基線平穩(wěn)以后，將配好的BPA等一系列雙酚類有機(jī)物的稀溶液用進(jìn)樣針從進(jìn)樣口依次進(jìn)樣，設(shè)定每一次的檢測時間為10min，記錄各樣品的出峰時間t，單位min。

4.樣品測定完后，關(guān)閉紫外檢測器。用超純水進(jìn)樣，清洗進(jìn)樣器中殘留的樣品，用100%甲醇流動相沖洗色譜柱約30min，關(guān)閉高壓泵。

四、實驗結(jié)果及數(shù)據(jù)處理

（一）實驗結(jié)果記錄

在表1中記錄七種雙酚類有機(jī)物在HPLC上的保留時間t，同時查閱現(xiàn)有的化學(xué)物質(zhì)安全手冊（MSDS）或其他工具書，或者利用Chemiffice軟件獲得這些雙酚類有機(jī)物的Kow，計算其對數(shù)，列于表1。

注：t為用液譜法測得的相應(yīng)物質(zhì)的保留時間；Kow由Chemoffice軟件獲得。

（二）確定log t與log Kow的關(guān)系

利用Origin軟件（或者其他科學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件）作log t-log Kow圖像，并進(jìn)行線性回歸，得到結(jié)果如圖3所示。

圖3得到方程為logKow=7.521×logt+1.06651，R2=0.89608。不難看出雙酚類有機(jī)物完全滿足Kow與保留時間t之間的對數(shù)線性關(guān)系，能夠很好說明當(dāng)有機(jī)物Kow加大時，其HPLC保留時間t延長的基本規(guī)律，而這一規(guī)律很好的反映了色譜分離原理在HPLC的實現(xiàn)機(jī)制，即有機(jī)物在流動相與固定相中不斷分配，達(dá)到平衡。而這個LC的分配原理與Kow的分配原理是一致的。在LC中固定相是C18，相當(dāng)于Kow中作為有機(jī)相的正辛醇；而流動相是甲醇-水混合液，相當(dāng)于是Kow中的水相。

（三）思考與討論

由圖3可知，實驗結(jié)果舉例中回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.89608，明顯大于臨界相關(guān)系數(shù)（R2=0.764，a< 0.01，n=7），說明具有顯著相關(guān)性。但是相對而言，BPA和BPC的數(shù)據(jù)相關(guān)性最差。這可能是由于下列原因引起的：（1）實驗由本組所有成員分別進(jìn)樣，可能是由實驗中實驗者的操作習(xí)慣或操作失誤所造成的；（2）液相色譜的手動進(jìn)樣器松動，在換新的進(jìn)樣器前所得到的數(shù)據(jù)可能并不準(zhǔn)確；（3）由于實驗中BPA等物質(zhì)的濃度沒有控制，濃度過高的有機(jī)物對色譜峰展寬，給其保留時間t測定帶來較大誤差。

五、結(jié)論

通過近年的教學(xué)實踐，該實驗教學(xué)方案取得了良好效果，既幫助學(xué)習(xí)者生動快速地理解掌握HPLC的分離原理與實現(xiàn)方式，又讓他們能夠延伸知識點，掌握分配的重要基礎(chǔ)和參數(shù)，以及判斷有機(jī)物的保留時間，利用MSDS數(shù)據(jù)和操作Chemoffice軟件等本領(lǐng)。另外，本設(shè)計對儀器條件要求較低，有利于在此基礎(chǔ)上進(jìn)行實驗的擴(kuò)展，既適于化學(xué)專業(yè)作為色譜實驗系列教學(xué)內(nèi)容的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，又適于非化學(xué)專業(yè)（尤其是生物、環(huán)境、食品科學(xué)專業(yè)）將其作為基本實驗教學(xué)內(nèi)容加以應(yīng)用。

[ 參 考 文 獻(xiàn) ]

[1] http：//chemwiki.ucdavis.edu / Wikitexts / UC_Davis / UCD_

Chem_115_Lab_Manual / Lab_2%3A_High_Performance_

Liquid_Chromatography.

[2] 鄧南圣，吳峰.環(huán)境化學(xué)教程（第二版）[M].武漢：武漢大學(xué)出版社，2006.

[3] USEPA.Standard Test Method for Partition Coefficient（N-Octanol / Water） Estimation by Liquid Chromatography.E1147-92，1997.

[責(zé)任編輯：羅 艷]