體外MTT法對靈芝酸抗人乳腺癌細胞株MCF—7作用的評估

摘要：目的 初步探討靈芝酸對乳腺癌的抗腫瘤作用。方法 用不同濃度（μg/ml）的靈芝酸溶液分別與MCF-7細胞共育24、48、72h后進行形態學觀察，同時MTT法測定靈芝酸的細胞毒作用。結果 在100μg/ml時共育72h后，對MCF-7細胞的生長具有顯著抑制作用（P<0.01）。在200μg/ml時共育24h后，對MCF-7細胞的生長具有明顯抑制作用（P<0.05），72h后抑制作用更為顯著（P<0.01）。隨藥物濃度增加，對MCF-7的作用呈增長趨勢，形態學觀察，在400μg/ml和800μg/ml對MCF-7細胞以毒殺作用為主。結論 靈芝酸對乳腺癌細胞有明顯抗腫瘤作用，且機制復雜。

關鍵詞：靈芝酸；乳腺癌細胞；MTT

靈芝Ganoderma lucidum （Curtis： Fr.） P. Karst.在真菌分類上屬于擔子菌門 （Basidiomycota），靈芝科（Ganodermataceae），靈芝屬（Ganoderma p，karst），在國內有20余種，包括赤芝、黃芝、紫芝、黑芝、薄蓋靈芝及樹舌等，多分布于云、貴、冀、吉、浙、閩等省。現已從靈芝中分離得到多糖類、靈芝酸類、核苷類、呋喃類、生物堿類、氨基酸蛋白質類、油脂類、甾醇類、無機離子類、有機鍺等十大類化合物。目前研究較多的是靈芝多糖，具有抗腫瘤、抗氧自由基、抗衰老、提高免疫力、活血化瘀等生物活性[1]。靈芝酸是近年來從靈芝中分離得到的一類具有廣泛藥理活性的物質，是當今靈芝研究的一個熱點。研究表明靈芝酸具有降低膽固醇、護肝排毒、抑制組織胺釋放、止痛、鎮靜、毒殺腫瘤等功能，是靈芝的主要有效成分之一。本文對靈芝酸抗乳腺癌細胞株MCF-7作用進行實驗。

1 資料與方法

1.1一般資料 DMEM培養基（購自Gibco公司）及培養用胎牛血清（FCS，天津TBD），MTT，0.25%胰酶購自上海公司；青、鏈合劑、碳酸氫鈉，DMSO溶液，臺盼藍， PBS溶液為本院中心實驗室提供。靈芝酸購自南京中醫藥大學，細胞株MCF-7人乳腺癌細胞株購自ATCC 上海。

1.2方法 MTT檢測：癌細胞的體外培養條件：37℃，5%CO2，飽和濕度保濕培養，MCF-7人乳腺癌細胞所用培養基為：DMEM，加入10%胎牛血清，4萬u青、鏈合劑。對癌細胞的抑制作用測定：將新鮮培養的細胞制成1×104/mL的懸液，移接于96孔細胞培養板中，每孔200μl，加入不同濃度的靈芝酸樣品，培養24、48、72h后進行測定。MTT檢測：細胞處理24、48、72h后每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃繼續孵育4h，停止培養。小心吸去孔內培養上清液，每孔加入100μl DMSO，振蕩10min，使結晶物充分溶解。選擇490nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值（OD），OD值與活細胞數量成正比。細胞存活率=實驗組光吸收值/對照組光吸收值；藥物抑制率=（1-實驗組光吸收值/對照組光吸收值）×100%。

2 結果與分析

MTT檢測結果如表：測得結果的顯著性均以（x±s）表示，用t檢驗進行分析處理。見表1、表2。

靈芝酸生物活性如圖1（圖1為3d測定結果）。

3 討論

我國對靈芝有效成分的研究已有較多報道，但多局限于靈芝多糖的研究，在靈芝酸研究方面開展較少。雖然靈芝酸種類達上百種之多，但在靈芝中的含量卻很低，僅為 0.15%～1.2%左右。我們對從靈芝中提取分離獲得的靈芝酸進行了抑制乳腺癌細胞株MCF-7的研究。

目前用于細胞和細胞因子活性檢測采用同位素、臺盼藍法和MTT等方法。前兩者雖然有各自的優點，但存在著一定的局限性，如操作過程復雜，檢測周期長，需要特定的儀器設備，易污染環境等缺點。MTT比色法以其快速、靈敏、簡便、準確等優點受到廣泛的應用。其基本原理為：MTT，即溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑，簡稱四唑鹽，又名噻唑藍；MTT產品為淡黃色粉末，易被水溶解和透過細胞膜而進入細胞內，MTT可被活細胞線粒體呼吸鏈上的琥珀酸脫氫酶還原，形成不溶于水的藍紫色結晶（Formazam），死細胞則無此功能。該結晶可溶于酸性異丙醇、二甲基亞砜、SDS等有機溶劑中，通過多孔掃描分光光度計依顏色深淺可測定出各吸光度值。由于結晶物形成的量與活細胞數量及代謝活性成正比，因此吸光度值的大小可反映出細胞的數量及活性。

本實驗觀察到與對照組比較，0.5% CMC-Na對人乳腺癌細胞株MCF-7細胞的生長無抑制及毒殺作用，且與作用時間無關。靈芝酸濃度在50μg/ml時，48h內對MCF-7細胞的生長無明顯抑制作用（P>0.05），而72h后作用明顯（P<0.05）。結合光鏡觀察，發現其以抑制作用為主。在100μg/ml時共育72h后，對MCF-7細胞的生長具有明顯抑制作用（P<0.01）。在200μg/ml時共育24h后，對MCF-7細胞的生長具有明顯抑制作用（P<0.05），72h后抑制作用更為顯著（P<0.01），這與Gao[2]等和Wu[3]等的結果相符。IC50（半數抑瘤濃度）值為150μg/ml。隨藥物濃度增加，對MCF-7的作用呈增長趨勢，且與作用時間呈正相關，這種現象可能與抑制信號傳導有關。

從表2可以看出，共育24h后，除50μg/ml的濃度外，其余各濃度均有明顯效果。而50μg/ml的靈芝酸濃度之所以無效，我們考慮是由于濃度較低，作用時間較短所致，隨作用時間的延長，其抑制效果也很明顯。3d平均藥物抑制率為56.66%。

現代研究[4]表明，機體抗腫瘤機理主要依賴于細胞免疫功能，而擔負細胞免疫功能的細胞主要是體內的T細胞和NK細胞。NK細胞是一種不依賴胸腺、抗體和補體就能直接殺傷腫瘤的細胞，其活性的增加可抑制腫瘤生長和轉移。

本實驗是體外試驗， 與體內實際效果必然有一定差別。在體內癌細胞增殖與宿主的代謝、與體內的藥物相互作用是非常復雜的，受到藥物劑量、給藥方式、體內環境、聯合用藥等多種因素影響，所以靈芝酸對乳腺癌的作用尚需結合臨床情況全面考慮。此外，尚需進一步實驗探索，從分子水平探討靈芝酸抗腫瘤作用的機制。

展望：初步研究已證實靈芝酸具有抗人乳腺癌細胞株MCF-7細胞的作用，但尚需進一步實驗探索，從分子水平探討靈芝酸抗腫瘤作用的機制。需進行實驗探索靈芝酸抗其他腫瘤細胞的效果。進一步開發靈芝酸的其他藥理活性。

參考文獻：

[1]張衛國，劉欣，陳永泉.靈芝多糖的研究進展[J].飲料工業，2003，6（4）：5-10.

[2]Gao JJ， Min BS， Alm EM， et al. New triterpene aldehydes.lucialdehydes A-C， from Ganoderma lucidum and their cytotoxicity against murine and human tumor cells[J].Chem Pharm Bull，2002， 50（6）： 837-840.

[3]Wu TS， Shi LS， Kuo SC. Cytotoxicity of Ganoderma lucidum triterpenes[J].J Nat Prod 2001，64（8）：1121-1122.

[4]梁軍，孫朝陽，李予蓉.靈芝 912對受照小鼠免疫功能的影響[J].中華放射醫學與防護雜志，2003， 23（1）：46-47.

編輯/哈濤