半乳甘露聚糖檢測用于侵襲性曲霉菌早期感染診斷的研究

摘要：目的 評價酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測半乳甘露聚糖（GM）抗原在侵襲性曲霉菌（IA）早期感染診斷和療效監測中的臨床價值。方法 以62例呼吸內科、重癥醫學科及血液內科造血干細胞移植（HSCT）患者為研究對象，針對患者連續檢測，共檢測標本188份。采用ELISA法測定患者血清中GM含量，測定濃度可達0.5ng/ml。同時對所選病例進行G實驗檢測和真菌培養，所得結果與GM結果聯合分析。結果 以1.0為陽性界值，GM檢測的敏感性為53.8%，特異性100%，診斷符合率88.7%；以0.5為陽性界值，敏感性為84.6%，特異性96.7%，診斷符合率95.2%。G實驗顯示以GM0.5為陽性界值GM陽性患者血漿（1-3）-β-D-葡聚糖含量為（68.58±12.76）pg/ml，GM陰性患者血漿（1-3）-β-D-葡聚糖含量為（3.18±1.25）pg/ml，兩組數據經t-檢驗比較具有統計學意義（P<0.05）。GM檢測可早于真菌培養方法9d預測曲霉感染。曲霉菌感染患者GM的連續監測顯示抗曲霉菌治療前GM水平保持在較高水平，抗真菌治療有效患者的GM含量呈下降趨勢，無效死亡患者仍保持較高水平。結論 血清GM檢測是侵襲性曲霉菌早期感染診斷和療效監測的有用指標，與G實驗聯合應用判斷效果更好。

關鍵詞：半乳甘露聚糖；曲霉菌；早期感染

近年來侵襲性曲霉菌感染（IA）發病率逐漸增多，已經成為免疫功能低下患者致死率高的主要原因。有報道稱在造血干細胞移植（HSCT）患者中IA的發病率為2%～26%，實體器官移植患者中的發病率為1%～15%，死亡率可達到74%～92%。在中性粒細胞減少的患者（抗腫瘤治療后）和使用免疫抑制劑（干細胞移植、器官移植特別是骨髓抑制）或皮質類固醇的患者，患者一旦發生曲霉菌感染，死亡率高達50%～90%。研究開發早期、快速、準確的診斷方法對疾病的預后具有決定性的意義。半乳甘露聚糖（GM）是曲霉菌絲壁上的熱穩定多糖抗原，有一個非免疫原性甘露聚糖核心和含半乳呋喃糖基的免疫反應性側鏈。其半乳糖殘基具有抗原性，目前檢測該成分快速診斷曲霉菌病受到廣泛關注，被稱為最有前景的檢測曲霉菌感染的血清學方法。

1資料與方法

1.1一般資料 取自2012年1月～12月皖南醫學院弋磯山醫院呼吸內科、重癥醫學科、血液內科住院患者送檢的血液、肺泡灌洗液等標本62例。實驗組32例，其中男20例，女12例，入選實驗組均符合以下標準：發熱（T>37.5℃），經廣譜抗生素治療4d后無效；長期中性粒細胞減少；胸部影像學檢查出現新發病灶或出現肺部感染癥狀。對照組30例，其中男19例，女11例，為相應科室同時期住院患者，均無深部真菌感染臨床癥狀。

1.2診斷標準 IA分3類：第1類確診IA，第2類高度懷疑IA（也稱臨床診斷），第3類可疑IA，診斷標準均符合歐洲癌癥治療組織真菌病研究組（EORTC/MSG）制訂的IA診斷標準[5]。

1.3樣本采集 患者每3～4d用真空采血管采靜脈血3ml，采血后48h內完成檢測。連續檢測GM抗原直到治療后癥狀和體征好轉、體溫下降至正常后2w，或患者死亡，或排除IA診斷為止。32例實驗組共檢測血清樣本128份，30例對照組檢測樣本60份。所有患者還同時進行影像學檢查，痰或血的病原菌培養，部分患者收集支氣管肺泡灌洗液進行培養及肺活檢進行組織培養或病理學檢查。

1.4 GM檢測方法 法國BIO-RAD公司的曲霉菌酶免檢測試劑盒（PlateliaTM Aspergillus EIA）簡述如下：分別加300μl被測血清或（質控物）到每個1.5ml聚丙烯試管，每個試管加100μl血清處理液，用力混合或震蕩以徹底混勻試管，100℃水浴3min，10000g離心10min，上清液用來檢測GM抗原。每個孔中加50μl酶結合物，然后加50μl處理過的血清標本上清液或質控物，封板37℃干燥孵育90min，洗滌5遍，每孔迅速加200μl底物顯色劑，避光室溫下孵育30min，每孔中加入100μl終止液，波長為450nm下測試每孔的吸光度（A值）。每次實驗cut-off值均值必須在0.3～0.8之間，陽性對照/cut-off值均值大于2，陰性對照值/cut-off值均值小于0.4作為實驗內質控。2次連續采集樣本均為陽性或者同一份標本連續兩次檢測均為陽性才能判斷該實驗結果為曲霉菌感染陽性。將IA剛開始治療時所測得的GM光密度與含1ngGM標準品所測得的光密度的比值（GM指數GMI）作為基礎值。在第7d治療結束時采血樣測得的GMI與基礎GMI相比較，當增加1.0時，被認為治療失敗。在第14d治療結束時采血樣測得的GMI與基礎GMI相比較，當增加1.0，被認為治療失敗。

1.5 G實驗檢測方法 真空采血管取靜脈血3ml后，混勻，3000r/min離心1min得富含血小板血漿，分離出血漿在10min內使用，取上述富含血小板血漿0.1ml加入裝有0.9ml樣品處理液中輕輕混勻后，70℃保溫10min，取出后立刻放入冷水浴中3min冷卻至30℃以下，即為待測血漿樣品，取待測血漿樣品0.2ml加入反應主劑中，輕輕混勻20s待完全溶解后用微量加樣器轉移至10×65mm無熱原平底反應管中，立刻插入MB-80微生物快速動態檢測系統中進行反應，反應結束后自動計算含量。

2結果

2.1不同界值時血清GM的結果及敏感性和特異性 患者血清的GM值計算公式為 被檢血清A 值/cut-off均值A值。如果以GM值1.0為陽性界值判斷標準，0.8

2.2 GM實驗陽性與G實驗結果 以GM值0.5為陽性界值，GM陽性患者血漿（1-3）-β-D-葡聚糖含量為（68.58±12.76）pg/ml，GM陰性患者血漿（1-3）-β-D-葡聚糖含量為（3.18±1.25）pg/ml，兩組比較有統計學意義（P<0.05）。

2.3連續監測GM值與療效的關系 GM檢測同時對患者進行標本接種培養，結果顯示GM檢測陽性可早于真菌培養方法9天預測曲霉感染，且對13例GM陽性患者進行抗曲霉菌治療，9例有效，4例無效死亡。每3～4d采集患者靜脈血進行GM值測定，連續14d，發現4例治療無效死亡患者的血清GM值居高不下或進行性升高，9例治療有效患者的血清GM值呈現下降趨勢。

3討論

侵襲性真菌感染是指侵襲性深部組織和內部以及全身的真菌感染，包括深部組織感染和真菌血癥。近20年來，由于大劑量廣譜抗生素、抗腫瘤藥物及免疫抑制劑的長期應用，各種導管在體內的介入以及惡性腫瘤艾滋病等免疫功能低下患者的不斷增加。侵襲性真菌感染的發病率明顯上升，在醫院感染中占有重要地位，日益成為患者死亡的重要原因之一[5]。侵襲性真菌感染臨床診斷比較困難，臨床表現可因感染部位不同、臨床癥狀體征不具有特異性，而不易與細菌感染相區別。目前GM診斷IA還存在著患者因素、實驗標準、標本因素等問題，因此需要針對不同科室的患者群以及標本類型等統一實驗條件，選取合適的OD值及陽性界值，使各實驗室之間具有可比性。該實驗選取了呼吸內科、重癥醫學科、血液內科的標本，但未詳細區分標本類型是血液還是肺泡灌洗液，且收集標本量較少，這在今后的實驗過程中需加以改進和豐富標本量。總之，GM檢測IA具有早期、快速、敏感性高、特異性高、診斷符合率高等特點，有待于在臨床實驗室廣泛開展，在臨床診斷IA時需綜合臨床癥狀體征及其他診斷措施，達到早期診斷、早期治療、降低病死率目的。

參考文獻：

[1]Yilmaz Turay U，Yildrim Z，Turkoz Y，et al.Use of pleural fluid C reactive protein in diagnosis of pleural of effusion[J].Respir Med，2000，94（5）：432.

[2]Anthiong PCY，Shiu SC，Tak WL，et al.Thoracoscopic management of malignant pleural effusions[J].Chest，1996，109：1234-1236.

[3]曾治平，羅江洪.侵襲性肺部真菌感染實驗室診斷研究進展[J].中國老年學雜志，2010，30（16）：2391-2393.

編輯/申磊