激光共聚焦顯微鏡在腫瘤研究方面的應用

摘要：激光共聚焦顯微鏡（LSCM）是當今世界上最先進的分子細胞生物學分析儀器。它在熒光成像基礎上加裝激光掃描裝置，利用計算機進行圖像處理，利用紫外光激發熒光探針，從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖像。目前在形態學、分子細胞生物學、神經科學、藥理學、遺傳學都有廣泛地應用，在腫瘤研究中更是成為新一代強有力的研究工具。

關鍵詞：激光共聚焦顯微鏡；腫瘤學；應用

激光共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope， LSCM）是在熒光成像基礎上加裝激光掃描設備，利用計算機進行圖像處理，使用紫外光激發熒光探針，以得到細胞或組織內部細微結構的熒光圖像。激光共聚焦顯微鏡（LSCM）目前在形態學、分子生物學、神經科學、藥理學、遺傳學、腫瘤學等醫學領域中得到了很好的應用，本文主要概述其在腫瘤學中的應用。

1基本原理

激光共聚焦顯微鏡（LSCM）利用激光掃描束經照明針孔形成點光源，對標本內平面上的每一點掃描，標本上的被照射點在探測針孔成像，由探測針孔后的光電倍增管或冷電耦合器件逐點或逐線接受，迅速在計算機監視器屏上形成熒光圖像，焦平面上的點同時聚焦于照明針孔，得到的共聚焦圖像是標本的橫斷面，此外在顯微鏡的載物臺上加一個微量步進馬達，使載物臺上、下移動，最小步進距離0.1μm，這樣細胞或組織各橫斷面的圖像都能清楚地顯示，實現\"光學切片\"的目的。

2熒光定性、定量

普通光學顯微鏡及電子顯微鏡僅能對腫瘤抗原進行定性分析，而對多標記細胞、組織標本的抗原表達、細胞結構特征以及抗腫瘤藥的作用機制等方面進行定量的觀察和監測，只能借助激光共聚焦顯微鏡來實現。Raucher等[1]在研究Skov-3，HELA和FaDu細胞對于熱反應性ELP（由重復的VPGXG組成的彈性蛋白樣多肽）的收時，以熒光標記3個細胞系中熱反應性ELP，通過LSCM定量觀察其吸收，發現當溫度高于其轉運溫度時，細胞對于ELP的吸收度增加，通過調節轉運階段的環境溫度來調控細胞對于ELP的吸收。

3細胞內離子測量

LSCM可以精確地測量細胞內Ca2+、K+、Na+、Mg2+等離子的含量。莫媛媛等[2]研究大黃素乙酰化物作用鼻咽癌CNE-1細胞后，其線粒體損傷及其與線粒體自噬的關系時，分別用5mg·L-1及10mg·L-1大黃素乙酰化物作用于CNE-1細胞，再利用激光共聚焦顯微鏡分別測定兩組細胞中線粒體膜電位，細胞內Ca2+及線粒體自噬的活性。發現被大黃素乙酰化物作用后的細胞，細胞內游離的鈣離子濃度升高，且細胞內出現酸性溶酶體增殖，其中包含線粒體探針標記的線粒體碎片等典型的自噬特征，且增加的趨勢呈劑量效應關系。

4粘附細胞的分選

細胞分選有兩種方式：一種適用于數量較多細胞的分選，即在特制的培養皿上有作過熒光染色和未作熒光染色的兩類細胞群，利用高能激光把染色的細胞群殺死，而保留未染色的細胞群并繼續培養；另一種適用于數量較少的突變細胞，轉移細胞和雜交瘤細胞，即利用高能量激光于底部帶膜的特制配養皿上在欲選細胞周圍切割成八角帶，而非選細胞則因在該幾何形狀之外而去除。

5組織光學切片及三維圖像重建

標本的各層光學切片經計算機圖像處理及三維重建軟件，可以得到其三維立體結構，從而可以十分靈活直觀地觀察組織的立體形態和空間關系。封巍等[3]通過LSCM這一功能對轉染至食管癌TE-1細胞及卵巢癌SKOV3細胞內反義VEGF寡核苷酸上熒光物質含量進行檢測，并對細胞的形態進行研究，發現不同組別細胞間的形態差異具有顯著診斷學意義。表明使用LSCM通過亞細胞形態學來對正常細胞和凋亡細胞作出精確診斷具可行性。Zhang等[4]使用LSCM對肝癌細胞、過度增生肝細胞及正常肝細胞作光學切片和三維圖像重建，對其細胞形態進行比較，發現肝癌細胞的細胞核是雜亂無章的，有異型，其染色體也是粗大不規則的，說明利用LSCM的三維圖像重建技術對于癌癥的診斷是十分有益的。

6間隙鏈接胞間通訊

間隙連接是動物細胞中通過連接子進行的細胞間連接。間隙連接的連接點處，雙脂層并不直接相連， 而是由兩個連接子對接形成通道，允許小分子的物質直接通過這種間隙通道從一個細胞流向另一個細胞。間隙連接能在細胞間形成電偶聯和代謝偶聯。電偶聯在神經沖動信息傳遞過程中起重要作用。代謝偶聯可使小分子代謝物和信號分子通過間隙連接形成的水性通道， 從一個細胞到另一個細胞。目前，間隙連接胞間通訊（gap iunctions intercellular communication，GJIC）與腫瘤發生之間的關系日益受到重視。Ma等[5]使用LSCM觀察肝癌HHCC細胞、SMMC-7721細胞和正常肝細胞QZG中的GJIC功能。結果表明GJIC的功能在正常肝細胞中明顯高于其他兩組。West印跡法表明，只有QZG細胞的CX32蛋白和CX43蛋白中有未經磷酸化的酪氨酸存在，說明人類肝細胞癌的發生與CX基因的異常表達及其信號傳導通路的障礙有關。

7腫瘤耐藥機制的研究

由于LSCM具備組織光學切片和三維重建功能，能夠十分靈活直觀的觀察組織立體形態和空間關系，加之LSCM能隨時采集和記錄檢測信號，使其對腫瘤細胞動態變化的檢測成為可能。

8結論

LSCM是一種新發展起來的檢測手段，因其高分辨率，特別是對細胞內離子的定量檢測，完整、清晰的細胞三維立體結構圖像重建方面，是傳統光鏡和電鏡所不能比擬的。它越來越引起醫學工作者的廣泛關注。近年來在腫瘤研究中得到廣泛的應用。目前，LSCM與光鏡、電鏡、流式細胞儀相結合已成為腫瘤研究的一大趨勢。

參考文獻：

[1]Raucher D，Chllkoti A.Enhanced uptake of a thermally responsive polypeptlde by tumor cells in response to its hyperthermla-mediated phase transition[J].Cancer Res，2001，61（19）：7163-7170.

[2]莫媛媛，侯華新.大黃素乙酰化物致鼻咽癌CNE-1細胞線粒體自噬活性的研究[J].中國癌癥防治雜志，2014，6（1）：1-3.

[3]封巍，鄭曉.激光共聚焦顯微鏡對反義VEGF寡核苷酸轉染 TE-1及SKOV3細胞系的光檢測[J].腫瘤學雜志，2011，17（2）：111-114.

[4]Zhang WH，zhu SN， Lu SL，et al.Three-dimensional image of hepatocellular carcinoma under confocal laser scanning microscope[J].World J Gastroenterol，2000，6（3）：344-347.

[5]Ma XD，Ma X，Sui YF，et al.Signal transduction of gap junctional genes， connexin32， connexin43 in human hepatocarcinogenesis[J].World J Gastroenterol，2003，9（5）：946-950.

編輯/孫杰