大腸埃希氏菌對喹諾酮類藥物的耐藥現狀及防治

摘要：喹諾酮類藥物（Quinolones，Qs）是一類合成廣譜抗菌藥，自20世紀60年代萘啶酸被運用于臨床醫學以后，同時喹諾酮類藥物的耐藥問題便接踵而至，這使得喹諾酮類藥物成為開發最活躍，更新換代最迅速的藥物。由于其具有抗菌譜廣，抗菌活性強，與常用抗菌藥物無交叉耐藥，已成為臨床治療感染性疾病的主要藥物之一。然而，隨著喹諾酮類藥物在人醫和獸醫臨床的廣泛、長期、大量盲目濫用，使得其耐藥性近年呈蔓延增長趨勢，耐藥程度越來越重，耐藥菌株越來越多。其中，大場桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性問題是當前國內外研究的熱點。本文綜述了大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物耐藥現狀及特點，并分析了其耐藥機制，簡要綜述了減緩耐藥性的一些防治策略。

關鍵詞：大腸桿菌；喹諾酮類藥物；基因傳遞；耐藥機制

1 大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥現狀和特點

針對大腸桿菌對喹諾酮類藥物耐藥趨勢日益嚴重的情況下，人們進行了大量的調查及科研工作，并取得了一定成果，同時也揭示了大腸桿菌的嚴重耐藥所產生的不良后果。

1.1 耐藥現狀 喹諾酮類藥物在國內90年代被廣泛使用，由于喹諾酮類藥物容易產生耐藥且作用機制相似，所以不同喹諾酮類藥物之間可能存在交叉耐藥。有關大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥調查和研究在國外開展得比較早。美國德克薩斯州休斯頓本.托比綜合醫院從1999～2004年從1700例患者中分離出21000株大腸桿菌，其中對氟喹諾酮類藥物不敏感大腸桿菌從1999的6%增加2004年的25% [1]。捷克斯洛伐克Zemkova M， Kotlarova J [2]等人做了一項關于尿路感染的大腸桿菌耐喹諾酮類藥物的實驗，從2001年到2006年從尿路感染的住院患者和門診患者中收集了11856株大腸桿菌并且測試了他們對喹諾酮類藥物的敏感性，結果顯示：住院患者中的耐藥大腸桿菌比例從2001年的2%增加到2006年的10%，門診患者耐藥大腸桿菌比例從1%增加到11%。

在獸醫臨床上，一相有關歐洲八國動物用三代喹諾酮類藥物\"馬波沙星\"的監測研究表明，從1994～2001年，\"馬波沙星\"在家禽和動物的MIC90： 從1.275ug/ml增加到5.098ug/ml（P=0.0230）3[3]。西班牙Sabaté M 4[4] 等人，對分離出的85株大腸桿菌（43株，25株，14株，1株分別來源于雞、人、豬、牛的廢水），進行遺傳系譜、致病島（pathogenicity islands，PAIs）、喹諾酮類藥物耐藥分析，結果顯示：人源性的耐氟喹諾酮類藥物大腸桿菌從雞傳遞給人的可能性要比人自身腸內大腸桿菌因氟喹諾酮的應用選擇出耐藥大腸桿菌的可能性要大，但同時有實驗表明禽類大腸桿菌耐藥性可能通過禽類制品食物鏈傳遞給人類[5，6]。

我國使用喹諾酮類抗菌藥物之初，大腸桿菌對喹諾酮類藥物敏感性極高，但隨著喹諾酮藥物的廣泛運用，各個地區都出現了耐藥性菌株的激增。北京醫科大學臨床藥理研究所研究發現，臨床分離的大腸桿菌對環丙沙星耐藥菌株1993年為3.3%，1996年上升到44.2%，1998年高達62.8%。2006和2007年，復旦大學華山附屬醫院聯合國內主要地區（北京、上海、浙江、廣州、武漢、重慶、甘肅、新疆）較有代表性的醫院從臨床分別分離出6072株和6527株大腸桿菌，06年對環丙沙星耐藥率為61.7%[7]，而07年產ELBL的E.coli耐藥率為71.8%，不產ELBL者為44.8%[8]。

我國獸醫臨床上的大量長期使用喹諾酮類藥物導致了嚴重耐藥的境況，有研究[9]利用藥敏實驗自動監測系統（trek Diagnostic System，Westlake，OH）分析了71株雞源大腸桿菌分離菌株對9種喹諾酮類藥物的耐藥性，結果表明臨床分離菌株對沙拉沙星、恩諾沙星、環丙沙星、二氯沙星、單諾沙星、奧比沙星和萘定酸呈現很高的耐藥性，耐藥率分別為69%、69%、55%、76%、69%、76%和99%；對蓋特沙星和左氧氟沙星有輕度的耐藥性，耐藥率分別為11%和13%。在71株分離菌株中，只有1株沒有耐藥性，對3種以上藥物有耐藥性的菌株占74%（52/72），對6種以上藥物有耐藥性的菌株占70%（49/70），呈現多重耐藥性，多重耐藥性甚至可能通過使用抗生素的種類、時間和劑量來進行調節。另外，趙春燕[10]報道， 20世紀90年代前、9O年代、9O年代以后（雞、豬）耐藥菌株百分比分別為： 28.73 %、43.19% 、53.47% ，說明大腸桿菌耐藥性逐漸增強，目前病原菌對大多數喹諾酮類藥的耐藥率達50% 以上。國家細菌耐藥性監測中心收集的從1994～2001年常見菌種對環丙沙星耐藥率的變遷可以看出，國內大腸桿菌對環丙沙星的耐藥率自1994 年開始一直維持在50%～60%左右[11]，而到了2000年～2003年從全國11個省份分離出家禽和豬源性大腸桿菌393株，藥敏實驗表明他們對環丙沙星的耐藥率已經達到了74.8%[12]。

綜合以上可以看出，雖然我國90年代以后才開始大量使用喹諾酮類藥物，但國內大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物耐藥率與國外相比則后來居上，那么人源性大腸桿菌對喹諾酮類藥物的高水平耐藥率，是否和喹諾酮藥物在獸醫臨床的大量長期的使用有關，耐藥基因是否可能通過動物種群傳遞給人，有關研究提出了這個可能性 [5，13，14]。

1.2 大腸桿菌對喹諾酮類藥物耐藥特點 美國休斯頓本.托比綜合醫院[1]從用藥時間，患者年齡，菌株的標本來源等方面分析大腸桿菌的耐藥性，有如下特點：①用藥時間越長，大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物不敏感率增加，通過二元回歸分析（P<0.001），耐藥率以1.024倍/月的速度遞增。②隨年齡的增加耐藥率增加，在年齡>65歲患者中耐藥株占到29%，而<65歲者為13%，兩者有明顯差異（P<0.001）。③住院患者的耐藥率高于門診患者。④ 痰樣本分離的菌株耐藥率最高。

2 大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥機制

通過近年來的研究表明，大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性產生主要有以下相關耐藥機制。

2.1 喹諾酮類藥物作用靶位的改變 喹諾酮類藥物的作用靶位主要在細菌的DNA回旋酶（gyrase）和拓撲異構酶Ⅳ（TOPOⅣ）。DNA 回旋酶是由2個A亞基（97-kDa）和2個B亞基（90-kDa）構成的四聚體，分別由gyrA 和gyrB基因編碼。拓撲異構酶Ⅳ是由2個C亞基和2個E亞基組成的四聚體，分別由parC和parE基因編碼。兩種酶作用機制相似，回旋酶作用DNA產生負超螺旋，并可以切斷和連接DNA環。TOPOⅣ同樣能松解正、負超螺旋，在切斷DNA環功能上要優于DNA 回旋酶。這兩種酶一起作用于DNA的復制、轉錄、重組和修復 [15]。喹諾酮類藥物與酶-DAN結合為藥物-酶-DAN復合物，這種復合物是藥物作用的基礎，它干擾了TOPOⅣ和DNA回旋酶的活性，干擾阻止DNA環的修復從而抑制DNA 的合成起作用 [16]。gyrB基因和parC基因突變可促進gyrA基因突變，導致耐藥性的產生。在抑制與反抑制的較量中，細菌編碼回旋酶的基因突變，亦然成了耐藥株的來源。喹諾酮耐藥決定區（quinolone resistance determiningregion，QNDR）即是A亞基或C亞基涉及關于氨基酸替代導致耐藥的區域，QNDR多位于與DNA結合的酶表面。對大腸桿菌而言，它的DNA回旋酶氨基酸替代區域位于第51-106位點之間的氨基酸，其中，發生突變最多的是83（Ser→Leu）和87（Asp→Gly）位氨基酸。這種突變導致了喹諾酮類藥物與酶-DAN親和力的降低，導致耐藥的產生。

2.2 大腸桿菌對喹諾酮藥物的主動外排 根據能量來源的不同，主動外排系統可分為質子依賴型多藥耐藥泵和ATP依賴型多藥耐藥泵2種類型，大腸埃希菌以前者為主。RND家族是大腸埃希菌產生多藥耐藥性最重要的家族之一，其中AcrAB-TolC系統為主要代表，是目前耐藥研究中的熱點，屬于質子依賴型，能夠產生對多種抗菌藥的高水平的多重耐藥，該系統主要由細胞內膜泵（AcrB）通過跨膜融合蛋白（AcrA）與外膜的排除泵（TolC）連接而組成，它有較寬的作用底物范圍，包括了喹諾酮類、氯霉素、四環素等多種抗生素、染料和去污劑等。用基因敲除技術人工去除acrAB或tolC基因時，大腸埃希菌對上述藥物的敏感性明顯增加。目前還發現，藥物分子外排主要和H 相偶聯，它們構成一個反向轉運蛋白，通道開放后，H﹢由于濃度梯度內流，藥物分子隨即外排[17]。

2.3外膜通透性下降 有研究[18]表明，大腸桿菌的外膜在耐藥過程中起著重要的作用。 大腸桿菌的外膜對許多抗菌藥物的通透性較低，形成一道天然的屏障，阻礙抗菌藥物進人菌體細胞內發揮抗菌作用.然而大腸桿菌外膜上存在的多種外膜蛋白質，對大多數疏水性藥物具有良好的通透性。親水的氟喹諾酮類藥物均主要通過大腸桿菌外膜孑L蛋白（OmpF和OmpC，主要是OmpF）進入細胞內發揮抗菌作用.然而，膜通透性的改變只能引起大腸桿菌低程度的耐藥。

2.4耐藥基因的傳遞 目前大家最為關注的問題是耐藥的菌株是否可能將耐藥基因傳遞給人類并導致感染性疾病，國外有一些實驗能夠給出較為肯定的答案。A.E.van den Bogaard等收集了作為常規加抗生素喂養的火雞、肉雞和不作為常規加抗生素喂養的蛋雞糞便中的E.coli，收集了喂養這些家禽的飼養者以及屠宰火雞、肉雞的工人糞便中的E.coli，并將上述獲得的E.coli做環丙沙星耐藥實驗及PFGE分型。耐藥結果顯示：源于火雞、肉雞及其飼養者和屠宰者耐藥率高于來源蛋雞及其飼養者耐藥率，并有顯著差異；PFGE分型：來源于兩個農場之間的E.coli PFGE分型存在差異，但來源于同一農場的火雞、火雞飼養者和屠宰者Ecoli的PFGE分型一致，這些結果強烈的暗示耐藥菌株的耐藥基因可能從家禽傳遞給人類；但同樣在荷蘭，一個肉牛農場常規使用喹諾酮藥物近20年，卻沒有發現廣泛的耐藥質粒流行，這種現象是否和動物種屬有關，有待于進一步研究。

在西班牙的巴塞羅那，有研究者集了117株E.coli，其中，35株源于人血培養，33株源于人糞便，49株源于雞糞便，通過環丙沙星耐藥實驗，毒力基因測定（papA、sfa/foc、iha、cnf1、fyuA、iutA、iss等21個毒力基因），RAPD和PFGE分型。結果：人源性耐藥Ecoli與敏感Ecoli的毒力基因具有較大差異但與雞源性耐藥Ecoli的毒力基因較為接近。

氟喹諾酮抗性質粒在耐藥性傳遞方面一直被認為只是一個誘因。Martínez-Martínez L等應用細菌結合試驗研究了氟喹諾酮抗性質粒的存在與否對E coli耐環丙沙星和奈啶酸突變頻率的影響，結果發現來自肺炎克雷伯氏菌的一個多重耐藥質粒pMG252轉入外膜孔道蛋白不完整的肺炎克雷伯氏菌可使其對環丙沙星的MIC達到32 mg/ml。這一質粒在其它腸球菌和假單胞菌有廣泛的宿主菌并能表達氟喹諾酮抗性。含有該質粒的E.coli其耐藥性突變的頻率比不含質粒的菌株的高100倍，且對環丙沙星的MIC值增高到原菌株的16倍。

3 防治對策

3.1 合理用藥 減緩細菌對氟喹諾酮類藥物耐藥的關鍵在于合理用藥。在一些發達國家大腸桿菌對氟喹諾酮類耐藥率為10%左右，而在我國達5O%以上，并且出現了較強的交叉耐藥性，主要是由于濫用、誤用引起。所以在用藥前需要做藥敏試驗，選擇應用高敏藥物，同時注意經常更換或交叉使用其他藥物以提高療效。除了參考藥敏試驗外，還應根據藥物在體內的分布特點選擇藥物和劑量。

3.2 嚴格控制人獸共用抗菌藥的運用 目前，我國獸用與人用抗菌藥物之間沒有嚴格區分，有的則把剛上市的人用新藥轉到獸醫臨床應用，這是細菌產生耐藥性傳遞的一個重要途徑。所以，各級藥政部門要嚴格把關，對人用抗菌藥轉為獸用應該慎重對待。

3.3 聯合用藥 通過聯合用藥可擴大抗菌譜、增強療效、減少用量、降低或避免毒副作用，減少或者延緩耐藥菌株的產生。有報道氟喹諾酮類與頭孢菌素合用時對它們各自的耐藥株具有協同作用。還有人證實，將多重耐藥泵抑制劑利血平與氟喹諾酮類藥物聯合運用能顯著抑制細菌對氟喹諾酮類藥物耐藥性的發生，堿化局部環境也可顯著提高氟喹諾酮類的抗菌活性[9]。

3.4 重視生態環境 抗菌素能夠在來源于醫院、制藥廠和喂抗生素飼料的養殖場的下水道和污水中找到，細菌耐藥可能從一個生態系統傳到另一個生態系統。面對細菌耐藥，要求我們不僅在醫院嚴格執行消毒制度，規范使用抗生素；也要求整個社會與抗生素相關的各行各業肩負起對抗細菌耐藥的責任。

3.5 研制新藥 研制新藥是解決氟喹諾酮類藥物耐藥問題的重要途徑之一。氟喹諾酮類藥物不是天然藥物，因此對其結構進行改造將是非常有效的方案，現已開發出第四代氟喹諾酮類藥物，但是我們仍然要警記，細菌的耐藥速度越來越快，解決耐藥的根本途徑在預防。

4 展望

細菌耐藥性的日益嚴重，迫使人們采取各種對策以保護人類自身的生存安全。喹諾酮類藥物不失為一類療效確切、抗菌廣譜的藥物，該類藥物盡管已經出現了不容忽視的耐藥性問題，但仍為許多疾病的治療首選藥。抗生素選擇壓力與細菌耐藥性的發展呈正相關，合理而有效地使用，杜絕亂用、濫用，除了在臨床抗感染治療中應合理使用氟喹諾酮類藥物；還要在農業、畜牧業中規范使用氟喹諾酮類藥物，這不僅保護了人類自身，也保護了一類抗菌藥。只有這樣，才能延緩甚至阻斷耐氟喹諾酮類藥物細菌的傳播和蔓延。

參考文獻：

[1]Boyd LB， Atmar RL， Randall GL， et al. Increased fluoroquinolone resistance with time in Escherichia coli from >17，000 patients at a large county hospital as a function of culture site， age， sex， and location[J] BMC Infect Dis， 2008，15（8）：1741-1747.

[2]Zemkova M， Kotlarova J， Merka V， et al. Emergence of fluoroquinolone resistance in Escherichia coli isolates at the department of clinical hematology [J].New Microbiol， 2007，30（4）：423-430.

[3]Meunier D， Acar JF， Martel JL， et al. Seven years survey of susceptibility to marbofloxacin of bovine pathogenic strains from eight European countries[J].Int J Antimicrob Agents， 2004 ，24（3）：268-278.

[4]Sabaté M， Prats G， Moreno E， et al. Virulence and antimicrobial resistance profiles among Escherichia coli strains isolated from human and animal wastewater [J].Res Microbiol， 2008，159（4）：288-293.

[5]Johnson JR， Sannes MR， Croy C， et al. Antimicrobial drug-resistant Escherichia coli from humans and poultry products， Minnesota and Wisconsin， 2002-2004. [J]. Emerg Infect Dis， 2007，13（6）：838-846.

[6]de Jong A， Stephan B， Silley P. Fluoroquinolone resistance of Escherichia coli and Salmonella from healthy livestock and poultry in the EU[J]. J Appl Microbiol. 2012，112（2）：239-245.

[7] 汪復，2006年中國CHINET細菌耐藥性監測[J].Chinese Journal of Infection and Chemotherapy，2008，8（1）：1-9.

[8] 汪復，2007年中國CHINET細菌耐藥性監測[J].Chinese Journal of Infection and Chemotherapy，2008， 8（5）：325-333.

[9] 楊漢春 ，陳聲 ，Jianghong Meng，等。雞源大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物的多重耐藥性[J]. 畜牧獸醫學報，2003，34（4）：398-404.

[10] 趙春燕，易世紅，王放，等.大腸埃希氏菌耐藥性監測及耐藥質粒的研究[J].微生物學雜志，2001，21（4）：41-42.

[11] 李景文.氟喹諾酮類藥物的臨床應用與不良反應[J].中華醫藥雜志，2003，3（8）：64-65.

[12]LEI Lian-cheng， ZHENG Dan， HAN Wen-yu， et al. Antibiotic Sensitivity Detection and Analysis of Escherichia coli Isolated Clini-cally in China[J].Chinese Journal of veterinary， 2005，5（25）：470-473.

[13]Xia LN， Tao XQ， Shen JZ， et al. A survey of β-lactamase and 16S rRNA methylase genes among fluoroquinolone-resistant Escherichia coli isolates and their horizontal transmission in Shandong， China[J]. Foodborne Pathog Dis. 2011 8（12）：1241-1248.

[14]Deng Y， Zeng Z， Chen S， et al. Dissemination of IncFII plasmids carrying rmtB and qepA in Escherichia coli from pigs， farm workers and the environment[J]. Clin Microbiol Infect. 2011，17（11）：1740-1745.

[15] Jacoby GA. Mechanisms of resistance to quinolones [J]. Clin Infect Dis， 2005 ，15（41）：120-126.

[16]Webber M， Piddock LJ. Quinolone resistance in Escherichia coli[J].Vet Res，2001， 32（3-4）：275-284.

[17]Nishino K， Yamada J， Hirakawa H， et al. Roles of TolC-de-pendent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to beta-lactams [J].Antimicrob Agents Chemother，2003 ，47（9）：3030-3033.

[18] 張小林，汪復，朱德妹.多重耐藥大腸桿菌外膜屏障機制的研究[J].中華傳染病雜志，1998，16（4）：195-197.

編輯/許言