下調(diào)miR—155表達(dá)對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖的影響

摘要：目的 miR-155在人類多種腫瘤中過表達(dá)。本研究觀察干擾miR-155表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE2增殖的影響。方法 使用脂質(zhì)體將miR-155抑制物 （miR-155 inhibitor）轉(zhuǎn)染CNE2，以無關(guān)序列（Control inhibitor）作為陰性對(duì)照。采用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證miR-155 inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞中miR-155的表達(dá)水平；采用MTS法測(cè)定各組細(xì)胞1d、2d、3d和4d的吸光度（OD）值，繪制生長曲線，觀察干擾miR-155表達(dá)對(duì)CNE2細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果 轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor的CNE2細(xì)胞中miR-155的表達(dá)明顯下調(diào)，并且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。表明轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor能有效抑制CNE2細(xì)胞中miR-155的表達(dá)。轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor的 CNE2細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比，增殖速度明顯減慢。差異具有顯著性（P<0.05）。結(jié)論 miR-155能促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖能力，它可能在鼻咽癌的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：鼻咽癌；miR-155；細(xì)胞增殖

miRNA是由長約19-24個(gè)核苷酸組成的非編碼小分子RNA，它通過降解靶mRNA或抑制靶mRNA的翻譯來調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)。MiRNAs參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程，包括生長發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、新陳代謝等 [1]。其中miR-155在許多類型的腫瘤中過度表達(dá)，且其過度表達(dá)被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系[2～4]。然而miR-155在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用目前并不清楚。本研究通過在鼻咽癌CNE2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor使miR-155表達(dá)下調(diào)，探討干擾miR-155對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響，從而初步揭示miR-155在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料 qRT-PCR miRNA Detection Kit購自上海吉瑪生物公司。MiRNA inhibitor為Ambion公司產(chǎn)品。RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司、胎牛血清來自杭州四季青公司。25ml培養(yǎng)瓶、96孔板（美國Coming公司）。MTS細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購自美國Promega公司。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 鼻咽癌細(xì)胞株CNE2為典型低分化鱗癌細(xì)胞，由我院研究所保存，培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI1640，在95%濕度，5% CO2，37°C條件下。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞接種于6孔板中，待貼壁細(xì)胞融合度達(dá)40%～60%時(shí)，根據(jù) Lipofectamine 2000說明書用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后6h換新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 qRT-PCR檢測(cè) 逆轉(zhuǎn)錄按吉瑪生物公司轉(zhuǎn)錄miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行，反應(yīng)體系如下：總RNA 70℃預(yù)變性10min，10×Buffer 2μl，10mM MgCl2 4μl，dNTP 2μl，Ribonuclease Inhibitor 0.5μl，AMV Reverse transcriptase（20U） 0.6μl，Oligo（dT）15 Primer 1μl，總RNA 1μg，無酶水至20μl。反應(yīng)條件：42℃ 1h，95℃ 5min，4℃ 10min。

PCR反應(yīng)體系如下（SYBR Premix Ex TaqTM 20μl體系）：SYBR Premix Ex TaqTM 10μl，F(xiàn)orward Primer（10μM） 0.4μl，Reverse Primer（10μM） 0.4μl，cDNA模板2.0μl，蒸餾水加至20μl。采用Bio-Rad IQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：Cycle 1： （1×），95.0 °C 30sec；Cycle 2： （40×），95.0 °C 5sec，60.0 °C 30sec。

1.5 MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 miR-155 inhibitor轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞24h后，將細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，放37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在未接種細(xì)胞的孔中加入RPMI-1640培養(yǎng)基中作為調(diào)零孔。接種后24、48、72和96 h各檢測(cè)一次。檢測(cè)時(shí)每孔加20μl MTS檢測(cè)試劑，37℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm波長吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染miRNA-155 inhibitor細(xì)胞內(nèi)miRNA-155表達(dá)變化 分別用Control inhibitor及miR-155 inhibitor（終濃度為10μM/L、30μM/L、60μM/L）轉(zhuǎn)染CNE細(xì)胞，48h后抽提細(xì)胞總RNA，運(yùn)用qRT-PCR驗(yàn)證miR-155在細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染不同濃度miR-155 inhibitor的細(xì)胞中miR-155的表達(dá)量明顯下調(diào)，并且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性（見圖1）。表明miR-155 inhibitor轉(zhuǎn)染能有效抑制CNE2細(xì)胞中miR-155的表達(dá)。

2.2 miR-155下調(diào)后CNE2細(xì)胞增殖速度下降 通過MTS法檢測(cè)，繪制生長曲線來觀察下調(diào)miR-155表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE2增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染不同濃度miR-155 inhibitor的CNE2細(xì)胞從第2d起增殖速度明顯減慢。統(tǒng)計(jì)分析各組在第4d時(shí)的細(xì)胞增殖情況發(fā)現(xiàn)，不同濃度miR-155 inhibito組與對(duì)照細(xì)胞組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），并且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性（見圖2）。

3 討論

鼻咽癌是一種頭頸部上皮來源的惡性腫瘤，具有高度的侵襲和轉(zhuǎn)移特性， 好發(fā)于中國南部[5]，它的發(fā)病與遺傳易感性以及EB病毒 （Epstein-Barr virus， EBV）感染有緊密聯(lián)系[6]。研究顯示， miRNA 與鼻咽癌存在緊密的關(guān)聯(lián)[7]。miRNA是一類廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的非編碼小RNA，主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，通過與其目標(biāo)mRNA分子的3'端非編碼區(qū)域（3'-untranslated region，3'UTR）互補(bǔ)匹配降解靶mRNA或抑制其翻譯[1]。研究表明，多種類型的腫瘤中都檢測(cè)到microRNAs的異常表達(dá)，異常表達(dá)的microRNAs通過對(duì)腫瘤抑制因子和癌基因的調(diào)控，在腫瘤發(fā)展過程中起重要作用[8]。作為microRNAs家族的一個(gè)重要成員，miR-155位于人類21號(hào)染色體上B-cellIntegration Cluster（bic）基因的第三個(gè)外顯子內(nèi)[9]，其序列為5'-UUAAUGCUAAUCGUGAU-AGGGG-3'。研究表明，miR-155在許多種類型的腫瘤中過表達(dá)，包括喉癌[10]、乳腺癌[11]、肺癌[12]、結(jié)腸癌[13]等，miR-155的過表達(dá)被認(rèn)為在這些腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。然而miR-155在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用目前并不清楚。本研究將miR-155 inhibitor轉(zhuǎn)染至鼻咽癌細(xì)胞CNE2細(xì)胞中，觀察miR-155下調(diào)對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor的CNE2細(xì)胞從第2d起增殖速度明顯減慢。我們的結(jié)果顯示miR-155能正調(diào)控鼻咽癌增殖能力，促進(jìn)鼻咽癌增殖，很可能作為一個(gè)癌基因參與鼻咽癌的發(fā)生與發(fā)展。因而它有可能成為鼻咽癌治療的潛在靶點(diǎn)。

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