紫薇抗寒性鑒定方法比較研究

摘 要：為探討紫薇抗寒性能力之間的差異，以7個紫薇品種為試驗材料，采用電導法、葉綠素熒光法和非損傷微測計數法對紫薇進行抗寒性鑒定，并與田間觀察試驗對比，研究了低溫對紫薇抗寒性指標的影響及不同鑒定方法與抗寒性之間的關系。結果表明：不同測定方法得到的抗寒性結果略有不同，與大田觀測結果相似，7個紫薇品種中以2號紫薇品種抗旱性最強，1號、5號和6號抗寒性較弱。植物抗寒性鑒定需要多種測定的綜合評價。

關鍵詞：紫薇；抗寒性；相對電導率；氫離子流

中圖分類號：S688 文獻標志碼：A 論文編號：2013-0664

Abstract： In order to analyze the differences on chilling tolerance of different Lagerstroemia indica L. varieties， the conductometry method， chlorophyll fluorescence method and NMT method were employed to measure various chilling tolerance parameters and their variation regularities in seven Lagerstroemia indica L. varieties. The effect of low temperature on chilling tolerance parameters of Lagerstroemia indica L. seedlings and the relationship between different appraisal methods and the chilling tolerance of different Lagerstroemia indica L. varieties was studied by comparing with the field observation. The results showed that： the cold resistance of Lagerstroemia indica L. under different determination methods was slightly different， which was similar to observations of field. The No.2 showed the strongest cold resistance among seven varieties of Lagerstroemia indica L. and No.1， No.5 and No.6 with the weakest cold resistance. Identification of cold resistance in plants needed comprehensive evaluation of various determinations.

Key words： Lagerstroemia indica L.； Chilling Tolerance； Relative Conductance Rate； H+ Flux

0 引言

紫薇（Lagerstroemia indica L.），屬千屈菜科紫薇屬，又名百日紅、癢癢樹等，產中國華東、中南及西南各地，距今已經有1500多年的栽培歷史[1]。紫薇花美麗而花期長，是極好的夏季觀花樹種，秋葉也常變成紅色或黃色，同時具有樹干光滑、枝條柔軟、抗污染等優點[2]，深受人們喜愛，在園林綠化中受到越來越多的重視，應用前景廣闊。

中國有紫薇屬植物21種，但由于氣候條件的制約，尤其是中國北方地區的低溫脅迫，在園林中應用的只有紫薇、南紫薇、福建紫薇和大花紫薇等少數幾種[3]。極度的低溫危害嚴重制約著紫薇在中國北方地區的正常生長發育，目前主要通過引種馴化選擇一些具有較高觀賞價值同時較為抗寒的品種，所以提高紫薇抗寒性，對于解決紫薇在中國北方寒冷地區普遍栽培，豐富園林景觀，具有十分重要的指導意義。本試驗擬通過電導法、葉綠素熒光法和非損傷微測離子流法，探明7個紫薇品種的抗寒性差異，為篩選抗寒性較強的品種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

田間觀察試驗于2011年10月—2013年5月在泰山林業科學研究院實驗林場進行，測試試驗于2013年4—6月在泰山林業科學研究院設施園藝中心和北京旭月科技有限公司進行。

1.2 試驗材料

供試材料為泰山林業科學研究院選育的觀賞性較強的紫薇品種：（1）‘羅漢崖1號’、（2）‘岱岳2號’、（3）‘金山4號’、（4）‘金山5號’、（5）‘溫江1號’、（6）‘復色花1號’和（7）四倍體紫薇‘四海升平’2年生實生苗）。

1.3 試驗方法

1.3.1 自然越冬試驗 選取生長健壯、一致的2年生紫薇實生苗，于2010年7月移入泰山林業科學研究院實驗林場，每品種選取50株進行觀察記錄，自然條件下越冬，于2013年5月統計紫薇死亡情況，計算成活率。

成活率=（某品種的成活數/該品種的總數）×100%

1.3.2 電導法測定 于2013年5月從生長健壯的紫薇各品種的植株上剪取長勢一致的當年生枝條，用自來水洗去枝條表面的污物，再用去離子水沖洗，用潔凈的濾紙吸去表面附著水分，放入4℃常溫冰箱中2天后再進行低溫處理：0℃作為對照處理，從0℃開始以5℃/24 h的速度降溫，每天取出部分枝條用電導法測定細胞質膜透性的變化，直到降到-20℃為止，共5次。

選取各紫薇品種的1年生枝條，剪成約1 cm的小段，混合均勻，每個品種稱取樣品3份，每份1 g，分別放入3個試管中（3次重復），每個試管中加入適量去離子水沖洗3次，將水倒掉，之后往每個試管中加入去離子水15 mL，將其放入恒溫振蕩箱振蕩30 min，取出后靜置6 h，用電導儀分別測定各個品種的初電導值C1。將試管放入水浴鍋中，煮沸30 min后取出，待冷卻后測定電導值C2。采用張憲政、牛立新等總結出的相對電解質滲出率表示方法中的一種來計算電解質的相對外滲率。

電解質的相對外滲率=（C1/C2）×100%。

抗寒性綜合評定：對各項指標測定值用隸屬函數[4]計算公式進行轉換，計算公式為：U（Xi）=（Xij-Ximin）/（Ximax-Ximin），相對電導率采用反隸屬函數的方法計算，計算公式為：U（Xi）=1-（Xij-Ximin）/（Ximax-Ximin），Xij表示第j個樣品第i個測定指標，U（Xi）∈[0，1]。將各品種所有指標的隸屬函數值進行累加，求其平均值得各品種的隸屬函數值。

1.3.3 葉綠素熒光法測定 于2013年4月選取生長健壯的紫薇各品種的植株當年生枝條，用水沖洗擦凈后，分別放入溫度為-1、-3、-5、-7、-9℃的人工低溫箱中處理10 h，處理結束后室溫解凍1 h，采用英國Hansatech公司生產的FM S-2型便攜式調制熒光儀測定各項熒光參數。測定前先暗適應30 min，然后照射檢驗光[<0.05 μmol/（m2·s）]測定葉片的初始熒光（F0），再用飽和白光[7200 μmol/（m2·s）]照1 s測最大熒光（Fm）。根據儀器測定的參數值和Schreiber等[5]的方法，結合以下公式Fv/Fm=（Fm-F0）/Fm，計算Fv/Fm值，每項指標測定3株，3次重復。

1.3.4 NMT法測定H+流變化 于2012年12月在北京旭月科技有限公司進行H+流變化測定，以紫薇各品種的叢生芽為外植體進行組織培養，待分化生根后從培養基中取出，室溫下適應3 h，然后轉入4℃冰箱中脅迫1.5 h，取出材料，用刀片將根冠切下，放在盛有測試液的培養皿中，以根尖（約20 mm）左右為測量區域，利用非損傷微測技術中的掃描離子選擇電極技術進行H+流測量，每次試驗5次重復，測試時間為低溫處理前10 min和低溫處理后45 min。

1.4 數據處理

數據采用EXCEL、DPS 7.05、SPSS 13.0進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 不同紫薇品種大田成活率比較

2010年泰安市冬季平均氣溫為-3.7℃，2011年為-3.8℃，2012年為-3.8℃，近年來冬季平均氣溫基本保持穩定，溫差在30℃左右，溫度低、溫差大是導致紫薇死亡的重要原因。通過連續3年記錄紫薇越冬成活率發現（表1），不同紫薇品種抗寒能力不同。其中2號品種抗寒性最強，與其他品種呈顯著性差異，成活率為91.3%，5號品種抗寒性最差，成活率為0。3號和4號品種抗寒性中等，差異不顯著，成活率均為51.3%。綜合7個紫薇品種，抗寒性能力強弱分別為2號>7號>3號=4號>1號>6號>5號。

2.2 電導法對不同紫薇品種抗寒性的測定

由表2可以看出，7個紫薇品種電解質的相對電導率隨溫度的降低而逐漸升高，各品種之間的變化幅度有差異，從而反映出了不同品種紫薇之間抗寒性的差異。如2號品種在0℃處理時相對電導率為13.7%，-10℃處理后相對電導率達到26.7%，而6號品種在0℃處理時相對電導率為22.2%，-10℃處理時相對電導率則升高到56.2%，達到半致死溫度。而其他6個品種均未達到半致死溫度，說明6號品種的抗寒能力在供試品種中最弱。

從表3中可以看出，不同品種在低溫處理下相對外滲率的差異狀況不同。在0℃處理中1號和5、6號品種間差異不顯著，3號和4、7號品種間差異不顯著，4號和7號品種間差異不顯著，其余品種之間差異顯著。在-5℃處理中1號和3號品種間差異不顯著，2號和7號品種間差異不顯著，3號和4號品種間差異不顯著，4號和5號品種間差異不顯著，其余品種之間差異顯著。在-10℃處理中2號和3、4號品種間差異不顯著，3號和4號品種間差異不顯著，其余品種之間差異顯著。在-15℃處理中1號和5、6號品種間差異不顯著，2號和4號品種間差異不顯著，4號和7號品種間差異不顯著，其余品種之間差異顯著。在-20℃處理中1號和5、6號品種間差異不顯著，2號和6號品種間差異不顯著，3號和5號品種間差異不顯著，4號和7號品種間差異不顯著，其余品種之間差異顯著。通過多重比較的結果分析可知，供試的7個紫薇品種之間確實存在抗寒性的差異。

植物的不同性狀對低溫脅迫的反應不同，單一的指標有時難以準確反映植物耐低溫能力的強弱。通過隸屬函數法，將眾多指標轉換成個數少且彼此獨立的新的因子，計算耐低溫的綜合評價值，能夠科學地對植物的耐低溫進行評價。由表4可以看出，2號紫薇隸屬度平均值最大（0.91），6號紫薇最小，隸屬度只有0.14。耐低溫性能力綜合評價名次為：2號>4號>7號>3號>1號>5號>6號。

2.3 葉綠素熒光法對不同紫薇品種抗寒性的測定

初始熒光（F0）是PSⅡ反應中心處于完全開放時的熒光產量，它反映了PSⅡ天線色素受激發后的電子密度，與葉片的葉綠素濃度有關。Fv/Fm是PSⅡ最大光化學效率，其變化程度可以用來鑒別植物抵抗逆境脅迫的能力[6]。在本試驗中，各處理植株F0隨著低溫脅迫時間的延長而上升，Fv/Fm則逐步遞減。2號紫薇在低溫處理過程中F0和Fv/Fm波動較小，而1號紫薇的F0則明顯上升，Fv/Fm顯著下降。-1℃～-3℃變化中，各參數值變化幅度最小，F0分別升高了4.1%、1.4%、4.5%、8.5%、6.1%、3.0%、4.5%，Fv/Fm分別降低了1%、0.3%、0.9%、0.6%、0.7%、1.1%、0.7%，-5℃～-7℃時各參數值變化幅度最大，-7℃～-9℃時各參數值變化幅度變小。由圖1可知，低溫對PSⅡ反應中心造成了傷害，使其光能轉化能力顯著下降，導致了紫薇葉片光合能力的降低甚至死亡。通過低溫脅迫下紫薇葉片葉綠素熒光參數的變化可以推測出不同紫薇品種間抗寒性能力的差異，本實驗中，7個供試紫薇品種抗寒性能力強弱依次為2號>7號>4號>3號>6號>5號>1號。

2.4 NMT法對不同紫薇品種H+流的測定

非損傷離子選擇電極技術很適合用來研究離子的跨膜轉運，它可以測定特定離子的流動[7]，利用離子選擇電極技術研究在低溫脅迫下紫薇根尖H+流的瞬時變化，試驗發現，7個紫薇品種根尖在低溫處理前H+均呈現內流趨勢，流量基本穩定在12～13 pmol/（cm2·s）（表5），低溫處理后H+內流減少，外流增加（圖2），有可能是因為低溫處理后質膜H+-ATPase活性增強導致H+外流增加內流減少，但低溫處理后初始流量不同說明不同紫薇品種間對低溫脅迫的適應性不同。其中2號和4號外流增加最少，分別增加了2 pmol/（cm2·s）和 2.5 pmol/（cm2·s），說明2號和4號紫薇受低溫影響最小。同時恢復室溫后的最終流量均沒有達到低溫處理前的流量，說明7個紫薇品種均受到低溫的不可逆傷害。盡管7個紫薇品種的測定部位相同，但不同基因型之間初始離子流差異較大，H+離子流的波動沒有表現出明顯的規律性。目前沒有報道明確表明H+流量和植物抗寒性之間的特定聯系，然而大量證據顯示抗逆性強的植物與抗逆性弱的植物間離子流的極值與波動幅度有顯著不同[8-10]。根據以往的報道和所測H+流的變化，可以推論7個紫薇品種中2號和4號為抗寒性較強的品種。

3 結論

低溫脅迫是世界范圍內影響植物產量和品質的主要非生物脅迫，植物抗寒性研究已成為活躍的研究領域[11]，目前用于鑒定植物抗寒性的方法主要有形態指標法、電導法、葉綠素熒光法等，通過離子流鑒定植物的抗逆性逐步引入到植物的抗生理中。

自Dexter首次用電導法測定植物的抗寒性以來，研究者不斷提出可以根據膜選擇透性的變化情況作為鑒定植物品種抗寒性的指標，經過逐步改進，目前在抗寒性研究中已被廣泛應用。Lyons等[12]認為，植物受到低溫影響時，細胞的質膜透性會發生不同程度的增大，電解質會有不同程度的外滲，以至于電導率會有所增加，抗寒性較強的植物的變化可以逆轉，易于恢復正常，而抗寒性弱的植物不僅透性增加，而且不能逆轉，以致造成傷害，甚至死亡。這種透性變化出現在外部形態的變化之前，因而可作為抗寒性的生理指標。

低溫脅迫對植物光合作用的影響是多方面的，葉綠素熒光測定技術被認為是探知植物體內生理狀態與環境變化的理想探針，通過熒光變化可以探測光合作用和熱耗散情況。F0是經暗適應的光合機構PSⅡ反應中心完全開放時的熒光強度，它與激發光的強度和葉綠素濃度有光，而與光合作用的光反應無關，Fv/Fm反映了PSⅡ反應中心的最大光能轉換效率，在非脅迫條件下，Fv/Fm的變化極小，但在逆境條件下，植物受到脅迫或其他原因猝滅了熒光，這一效率值則會明顯下降[13]。在本試驗中，隨著低溫脅迫程度的加劇，各處理均造成了F0的升高和Fv/Fm的降低，原因應該是低溫使植物受到了光抑制且導致了PSⅡ反應中心的失活或破壞。但不同紫薇品種間F0和Fv/Fm的變化幅度不同，原因可能是低溫不同程度地抑制了植物葉片的碳同化能力，抗寒能力弱的品種光能過剩，導致低溫光抑制，這與Fracheboud等[14]在抗寒小麥品種中的研究相似。

質膜是植物細胞最外面的界面膜，細胞與環境間的物質交換和信息傳遞過程必須依賴質膜。膜蛋白是膜功能的體現者，質膜的通道蛋白是植物細胞質膜上的一種重要功能蛋白。細胞通過這些通道與外界進行離子交換，離子通道在許多細胞活動中都起關鍵作用，它是生物電活動的基礎，在細胞內和細胞間信號傳遞中起著重要作用[15]。離子通道是細胞膜上蛋白質大分子組成的跨膜親水性通道，可被化學或電化學方式激活或抑制，從而控制離子通過膜的順勢流動，在形成、維持跨膜離子梯度和信號傳遞等生理過程中起重要作用。本試驗中，不同紫薇品種根尖在低溫中的H+流變化特征相似，均表現為H+外流，這種H+的外流是被動的，其中2號和4號外流增加最少，分別增加了 2 pmol/（m2·s）和2.5 pmol/（m2·s），說明2號和4號紫薇受低溫影響最小。而后氫離子外流逐漸降低，恢復到處理前流速，但H+流的波動沒有表現出明顯的規律性。目前沒有證據表明H+流和冷敏感植物間的特定聯系，然而大量證據顯示抗逆性強的植物與抗逆性弱的植物間H+的變化與波動幅度有顯著不同

4 討論

在低溫脅迫下，膜脂組成和透性開始發生變化，導致植物質膜選擇透性的改變或喪失，而膜透性的增加與外滲電導率呈正相關，膜透性的測定可作為植物抗寒性研究中的一個生理指標。筆者采用3種方法分別以莖段、葉片和根尖為樣本進行抗寒能力的測定，抗寒能力強弱分別為2號>4號>7號>3號>1號>5號>6號、2號>7號>4號>3號>6號>5號>1號和2號>4號>7號>3號>5號>6號>1號，與田間觀察有所偏差。Gusta等指出，對經過充分冷訓化的植物來說，實驗結果經常不一致。Abdolraouf認為電導法在實際應用時，必須謹慎的估計到葉片所處的生長階段和其他外部環境條件的影響。在H+流測定試驗中，所測溫度是通過人工設定的，不同幼苗間適應時間的不同也會導致離子流的變化。有報道認為簡單的離子流的平均值在特定時間內是無效的，而暴露在自然低溫下的離子流變化反而表現出較強的穩定性。同時可以推測紫薇根尖在低溫處理后H+內流減少與質膜H+-ATPase活性增強導致H+外流增加有關，這與高諄在鹽脅迫下楊樹細胞離子流變化結果相似。本試驗中，離子流的測定選用的是新生組培苗，離子流的變化與成熟植株間是否有差異還需要進一步了解，另外植物抗寒性生理指標和抗寒性的內在機理是復雜的，用任何單一生理生化指標來鑒定抗寒性是困難的，而以形態、生理生化的綜合指標聯合鑒定抗寒性，并且找出諸項指標間的關聯，使其規范化，才能獲得滿意的結果。

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