以核苷酸為原料保健食品中核苷酸的含量測(cè)定

【摘要】目的：建立以核苷酸為原料保健食品中核苷酸含量測(cè)定的方法。方法：采用定磷法[1] [2]測(cè)定以核苷酸為保健食品原料的保健食品中核苷酸的含量測(cè)定。結(jié)果：核苷酸在2.5ug～15μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r≥0.9995;回收率結(jié)果在98.6%-101.9%，RSD為1.29%（n=9）;。結(jié)論：定磷法簡(jiǎn)單、靈敏、快速、準(zhǔn)確，適用于以核苷酸為原料保健食品中核苷酸含量測(cè)定的方法。

【關(guān)鍵詞】核苷酸 保健食品 定磷法

Abstract：Objective：To establish a method to determine the total content of nucleotide contained in health food made with nucleotide as raw material.Methods：Total content of nucleotide contained in the health food were determined by Phosphorus determination method. Results： The content of nucleotide showed good linear relationship over the range of 2.5-15μg/ml （r=0.9999）.The recovery was 98.6-101.9% with RSD being 1.29%（n=9）.Conclusion：The phosphorus determination method is simple，sensitive，rapid，accurate and suitable for total content determination of nucleotide in health food made with nucleotide as raw material.

Keywords：nucleotide;Health food;Phosphorus determination method

【中圖分類號(hào)】R4 " "【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A " "【文章編號(hào)】1671-8801（2014）011- 0011-03

核苷酸是核苷與磷酸通過(guò)磷酸酯鍵結(jié)合構(gòu)成，糖環(huán)上的所有游離羥基（核糖的C-2、C-3、C-5）均能與磷酸發(fā)生酯化結(jié)合。生物體內(nèi)核苷酸多是5’-核苷酸;此外細(xì)胞中存在具有重要代謝功能的多磷酸核苷酸。用于保健食品原料中的核苷酸為單磷酸核苷酸。

目前，國(guó)內(nèi)外的核苷酸檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、紫外法、定磷法、毛細(xì)管電泳法。美國(guó)食品化學(xué)品法典：FCC8中收錄的核苷酸的檢測(cè)方法，其中CMP、UMP、AMP用高效液相方法，而GMP、IMP用紫外方法。國(guó)家輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)核苷酸檢測(cè)GMP采用紫外法，因此針對(duì)不同的核苷酸應(yīng)該用不同的檢測(cè)方法。

核苷酸為含有機(jī)磷[2]化合物，用濃硫酸將核苷酸中的磷轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)機(jī)磷，在酸性條件下與定磷試劑反應(yīng)生成磷鉬酸銨，用還原劑還原成深藍(lán)色鉬藍(lán)，在660nm[1]波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法得有機(jī)磷含量，計(jì)算得核苷酸的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DZKW電熱恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療儀器廠）;HM-200分析天平（萬(wàn)分之一）（日本AND公司）;AG135分析天平（十萬(wàn)分之一）（METTLER TOLEDO）;UV-2450紫外分光光度計(jì)（SHIMADZU）;TU-1901紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）;SP-1900UV紫外分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）;Agilent 1260液相色譜儀-泵（安捷倫）;Agilent 1260DAD檢測(cè)器（安捷倫）;Agilent B.04.02化學(xué)工作站（安捷倫）。

1.2 試劑

鉬酸銨（分析純）（批號(hào)：20100518，天津市化學(xué)試劑四廠（凱達(dá)化工廠））;抗壞血酸（分析純）（批號(hào)：20130307，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）;硫酸（分析純）（批號(hào)：20111109，丹東市龍海試劑廠）硫酸二氫鉀（分析純）（批號(hào)：20130830，天津市大茂化學(xué)試劑廠）;硫酸銅（分析純）（批號(hào)：20120206，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）;硫酸鉀（分析純）（批號(hào)：20100701，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）;過(guò)氧化氫（分析純）（批號(hào)：20120227，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）;甲醇（色譜純）（批號(hào)：1627507209，Merck KGaA）;磷酸（分析純）（批號(hào)：20110218，沈陽(yáng)市聯(lián)邦試劑廠）。

1.3 保健食品

珍奧?核諾膠囊（珍奧集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：20130302）

2 方法

2.1 "磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取標(biāo)準(zhǔn)磷溶液（5μg/mL）0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，用水補(bǔ)足到3.0mL，含磷量分別為0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0μg，加定磷試劑3.0mL后搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度（A660），以含磷量為橫坐標(biāo)，以A660為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 "供試品中總磷量的測(cè)定

2.2.1 "精密稱取（或量取）供試品適量（約含2.5-5mg核苷酸），置于消化瓶中，加入濃硫酸10mL及催化劑50mg，在消化爐上加熱至發(fā)白煙，樣品由黑色變成淡黃色，取下稍冷，加數(shù)滴30%過(guò)氧化氫液，繼續(xù)加熱至溶液呈無(wú)色至淡藍(lán)色為止，冷至室溫，用純化水稀釋到50mL，與樣品消化的同時(shí)做空白對(duì)照，空白瓶中不加樣品，用水代替，其他完全相同。（根據(jù)供試品含量可適當(dāng)調(diào)整取樣量及消化方式，最終制成約含核苷酸100μg/ml的消化液）

2.2.2 "取消化液1.0ml，加水2.0ml，定磷試劑3.0ml，搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度（A660）。空白對(duì)照同樣操作。

2.3 "供試品中無(wú)機(jī)磷含量測(cè)定

另取供試品適量，用水稀釋到50ml，取1.0ml，加水2.0ml，定磷試劑3.0ml，搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度（A660）。

2.4 "結(jié)果計(jì)算

首先制作標(biāo)準(zhǔn)磷曲線，以5.2項(xiàng)中消化和5.3項(xiàng)中未消化的供試品溶液測(cè)得的A660 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出總磷和無(wú)機(jī)磷的量，按式計(jì)算供試品中核苷酸的含量：

3 結(jié)果

3.1 線性和范圍

3.1.1測(cè)定方法：取標(biāo)準(zhǔn)磷溶液（5μg/mL）0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5， 3.0mL，用水補(bǔ)足到

3.0mL，含磷量分別為0，2.5，5.0，7.5，10，12.5，15.0μg，加定磷試劑3.0mL后搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A660），0點(diǎn)為空白，以含磷量（μg） 為橫坐標(biāo)，以吸光度值（A660）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：

標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.3 單項(xiàng)結(jié)論：標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.04998X+0.00382，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。

3.2 精密度

3.2.1 重復(fù)性

3.2.1.1對(duì)照測(cè)定：精密吸取6組標(biāo)準(zhǔn)磷溶液（5μg/mL）各1.0mL用水補(bǔ)足到3.0mL，加定磷試劑3.0mL后搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A660）。結(jié)果見表2。

3.2.1.2 供試品的測(cè)定：供試品為珍奧核諾膠囊（批號(hào)：20130302，理論含量：33.6%）;稱取供試品15mg，置于消化瓶中，加入10mL濃硫酸及50mg催化劑，在消化爐上加熱至發(fā)白煙，樣品由黑色變成淡黃色，取下稍冷，加數(shù)滴30%過(guò)氧化氫液，繼續(xù)加熱至溶液呈無(wú)色至淡藍(lán)色為止，冷至室溫，用純化水定容到50mL，與樣品消化的同時(shí)做空白對(duì)照，空白瓶中不加樣品，用水代替，其他完全相同。取消化液1.0ml，加水2.0ml，定磷試劑3.0ml，搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度（A660），空白對(duì)照同樣操作，測(cè)定總磷含量;另取供試品15mg，用水定容到50ml，取1.0ml，加水2.0ml，定磷試劑3.0ml，搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度（A660），測(cè)定無(wú)機(jī)磷含量，根據(jù)公式計(jì)算出供試品核苷酸的含量。結(jié)果見表3

3.2.1.3 單項(xiàng)結(jié)論：以上測(cè)定結(jié)果的RSD值分別為0.40%、0.49%.

3.2.2中間精密度

3.2.2.1 供試品的測(cè)定：3名分析人員用不同儀器對(duì)供試品進(jìn)行測(cè)定，供試品為珍奧核諾膠囊（批號(hào)：20130302，理論含量：33.6%）;稱取供試品15mg，置于消化瓶中，加入10mL濃硫酸及50mg催化劑，在消化爐上加熱至發(fā)白煙，樣品由黑色變成淡黃色，取下稍冷，加數(shù)滴30%過(guò)氧化氫液，繼續(xù)加熱至溶液呈無(wú)色至淡藍(lán)色為止，冷至室溫，用純化水定容到50mL，與樣品消化的同時(shí)做空白對(duì)照，空白瓶中不加樣品，用水代替，其他完全相同。取消化液1.0ml，加水2.0ml，定磷試劑3.0ml，搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度（A660），空白對(duì)照同樣操作，測(cè)定總磷含量;另取供試品15mg，用水定容到50ml，取1.0ml，加水2.0ml，定磷試劑3.0ml，搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度（A660），測(cè)定無(wú)機(jī)磷含量，根據(jù)公式計(jì)算出供試品核苷酸的含量。結(jié)果見表4

3.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線：

（1）Y=0.04899X+0.00260 "相關(guān)系數(shù)r為0.9997

（2）Y=0.05017X-0.00140 "相關(guān)系數(shù)r為0.9998

（3）Y=0.05073X-0.00854 "相關(guān)系數(shù)r為0.9999

3.2.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.2.4 單項(xiàng)結(jié)論：測(cè)定結(jié)果的RSD值為0.40%。

3.3 準(zhǔn)確度

3.3.1加樣回收率：精密稱取9份供試品各15mg，分為低、中、高3組，每組3個(gè)樣品，分別往各組供試品中加入含400μg、500μg、600μg的標(biāo)準(zhǔn)磷儲(chǔ)備液置于消化瓶中，加入10mL濃硫酸及50mg催化劑，在消化爐上加熱至發(fā)白煙，樣品由黑色變成淡黃色，取下稍冷，加數(shù)滴30%過(guò)氧化氫液，繼續(xù)加熱至溶液呈無(wú)色至淡藍(lán)色為止，冷至室溫，用純化水定容到100mL，與樣品消化的同時(shí)做空白對(duì)照，空白瓶中不加樣品，用水代替，其他完全相同。取消化液1.0ml，加水2.0ml，定磷試劑3.0ml，搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度（A660），空白對(duì)照同樣操作，測(cè)定總磷含量;另取供試品15mg，用水定容到50ml，取1.0ml，加水2.0ml，定磷試劑3.0ml，搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度（A660），測(cè)定無(wú)機(jī)磷含量，根據(jù)公式計(jì)算出供試品核苷酸的含量。結(jié)果見表4（供試品磷含量μg=15mg×33.45%×1000÷11÷100）

3.3.2 單項(xiàng)結(jié)論：回收率結(jié)果在98.6%-101.9%，RSD=1.29%

3.4 對(duì)比實(shí)驗(yàn)

3.4.1 方法

方法一：保健食品中核苷酸的測(cè)定方法（2003）;

方法二：本方法（定磷法）。

3.4.2 對(duì)比結(jié)果

3.4.2.1 供試品

供試品：珍奧核諾膠囊（批號(hào)：20130302），理論含量：33.6%。

3.4.2.2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

4 討論

試驗(yàn)結(jié)果證明所建立的定磷法簡(jiǎn)單、靈敏、快速、準(zhǔn)確，適用于以核苷酸為原料保健食品中核苷酸含量測(cè)定的方法。但由于本方法通過(guò)測(cè)定有機(jī)磷來(lái)推算核苷酸的含量，因此當(dāng)配方中含其他有機(jī)磷化合物時(shí)，本方法不適用，存在局限性。

參考文獻(xiàn)：

[1] 抗壞血酸一鉬藍(lán)顯色定磷法檢測(cè)轉(zhuǎn)移因子制劑中核苷酸的含量， 宋紅波，黑龍江醫(yī)藥Heilongjiang Medicine Journal Vo1.22 No.2 2009;

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[3] 寡核苷酸類藥物磷的定性定量分析，李保山，CHINA MEDICINE AND PHARMACY，2013年4月第3卷第8。