ELISA測定中常見問題及原因分析

摘要：目前，酶聯免疫吸附法（ELISA）是最為常用的感染性標志物檢測手段，其測定結果的準確、可靠性直接影響到臨床診斷及治療效果，在臨床實際操作過程中，常常會由于儀器、試劑、工作人員操作等方面的原因而影響ELISA測定結果。為進一步提高ELISA測定結果的準確性，本文主要分析了臨床實踐中常見的幾種問題及其原因，為臨床實踐提供重要的參考依據。

關鍵詞：ELISA測定；常見問題；原因分析

【中圖分類號】

R45 【文獻標識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）07-0254-01

ELISA測定的主要原理是利用抗原、抗體之間的特異反應通過某一種或幾種酶來連接待測物，通過底物和酶的相互作用，會改變溶液的顏色，進而通過觀察溶液顏色來判定測定的結果^[1]。在醫院檢驗科，ELISA是最為常用，也是最為重要的一種感染性標志物檢測方法，筆者主要結合自己多年的經驗，針對ELISA測定實踐中存在的常見問題及其發生原因進行剖析，具體分析如下。

1 常見問題

在醫院檢驗科進行ELISA測定過程中，常常會碰到整板顯色、白板、無法檢測出弱陽性質控樣本以及測定重復性較差等問題。①整板顯色主要表現在沒有徹底清潔洗板，污染了洗液，進而導致顯色液毀壞、變質，或者是加反酶結合物，通常這種問題主要存在于HBsAb、HBsAg測定中。②白板主要是指整板無色，也將陽性對照包括在內，比如像洗液中存在酶抑制劑，酶結合物漏加，顯色劑漏加A或B。或者是將終止劑當做顯色劑用。③無法檢測出弱陽性質控樣本。比如顯色時間不足，不能準確判定樣本測定結果；或者是溫度沒有達標，溫育時間不足等。④測定重復性較差。具體指標本處理方法不對，沒有正確處理酶標儀濾光片，混合應用不同批號的試劑組，微板孔條受到污染，顯色時間、洗板時間、溫育時間協調不一，樣本加錯，樣本添加不準確。

2 常見的問題原因分析

2.1 假陰性出現的原因分析及建議：

導致假陰性的原因主要包括以下幾種情況，①如果檢測大批量樣本，實驗室檢測人員的工作量比較大，有時候可能觀察樣本呈色不及時，很多樣本在實驗者觀察時，結果已經褪色，導致樣本呈現假陰性。②試劑自身的質量并沒有達標，比如已經過了保質期，試劑保存的方法不恰當，在試劑運輸的過程中，破壞了樣本，蒸餾質存在其他混合物。如果缺乏陰陽對比，極易出現假陰性。③溫育、溫度不充分，作用時間過短，忘記添加底物顯色劑或者酶標二抗等，這些原因都可能導致出現假陰性。④部分生產試劑廠家經濟條件較差，儀器、設備等比較落后，特別是若為人工包被的話，和普通試劑相比，生物活性材料存在很大不同，常常容易出現“漏包”、抗體（抗原）失去活性或活性不足等現象，進而出現假陰性。⑤在檢測的過程中，加樣技術非常重要，由于ELISA 測定法僅僅是微量樣品，如果多加1ul樣品或者少加1ul樣品，極易導致檢測標本的測定結果一時陽性，一時陰性。

目前，很多廠家為了增加視覺的直觀性，更加容易區分樣本的陰陽性，常常會利用濃度較高、陽性較強的對照作為陰陽對照的參考，這樣的后果是在肉眼觀察樣本測定結果的過程中，極易出現模棱兩可的局面而無法直接判斷出結果，必須在酶標儀的輔助下才可以準確判讀結果。但是由于酶標儀的靈敏度較低，重復性良好，可能有5%左右試劑盒陽性率會漏掉。因此筆者認為，臨床在HBsAg 檢測過程中，同時也應該檢測1 IU/ml 的臨界值血清。在樣品中不要添加Na2N3，避免酶活力受到抑制。且建議在醫院檢驗科應配備洗板機，避免出現洗板次數過多、沖力過大、浸泡過長等影響樣本檢測正確性的現象。

2.2 樣本假陽性的原因分析及其建議：

導致樣本出現假陽性的原因主要包括以下幾種情況：

2.2.1 吸附作用。很多SLE或者類風濕等具有自身免疫疾病患者，他們的血清中常常會存一些特殊組成成分對樣本測定的結果準確性造成影響，比如在包被板上會輕微吸附著一些IgG 抗體，這些附著的IgG抗體會導致之前顯示陰性樣本顯色，這種情況顯然是失真的。如果遇到這種情況建議結合樣本具體情況進行判斷，并且應該在樣本測定結果中標注特殊情況。

2.2.2 標本中雜質的影響。在檢測標本中，如果血液樣本黏稠度過高，血清脂質含量、膽紅素含量、血紅蛋白含量等過高，都會干擾ELISA測定結果，出現假陽性結果。

2.2.3 內源性物質。據相關數據統計^[3]，大約有40%左右的學者認為樣本血清中都存在某些對ELISA測定結果存在交叉反應物質、醫源性誘導抗鼠Ig（s）抗體、嗜異性抗體、補體、類風濕因子或者其他干擾作用物質等，在一定程度上會干擾樣本測定結果的準確性，會導致樣本檢測結果出現假陽性。

2.2.4 外源性物質。在采集樣本和保存樣本的過程中，常常會由于實驗室操作人員操作不規范而導致樣本測定結果出現假陽性。比如：①樣本溶血現象。這種問題常常是由于人為操作因素所致，在破壞溶解紅細胞過程中會產生大量血紅蛋白，ELISA的標記主要以辣根過氧化物酶為主，而這些血紅蛋白的過氧化物酶活性較強，因此一旦采集標本出現溶血現象，會出現非特異性顯色反應，導致樣本檢測出現假陽性現象。因此臨床檢驗實踐中應重視標本溶血問題。②保存標本的方法不恰當，如果存放存標本的時間在1d以上，則很容易導致標本活性喪失或大大降低，出現假陰性問題。如果標本待檢時間過長，標本血清中IgG 抗體極易形成多聚體，而AFP抗體極易形成二聚體，二聚體和多聚體相互結合極易導致本底過深，進而使樣本測定結果出現假陽性。因此在臨床檢測過程中，應該在最短的時間內進行ELISA 測定，如果由于特殊情況必須將測定時間延長，則應該將標本存放環境設定為4℃恒溫（5d內）。若標本在7d后檢測，應采取低溫冷凍處理，在檢測前再測解凍，并輕輕充分搖勻后測定。

2.2.5 并沒有全面凝集標本。由于血液采集后在30min-2h后逐漸開始凝固，在24h左右會完全凝固，因此在ELISA 檢測過程中，常常會在血液標本中適當添加一些促凝劑或抗凝劑，為了爭取有效的檢測時間會強行將血清分離出來。此時血清中仍然有部分纖維蛋白原殘留，并極易形成纖維蛋白塊，這些肉眼可見的纖維蛋白塊會使實驗者判斷失誤，導致樣本測定出現假陽性。這種問題其實比較好解決，導致這種現象的主要原因是血液還沒有完全凝固所致，臨床檢測時只需要待血液完全凝固后分離血清即可。如果特殊情況下需要快速檢測，則應該使用分離膠采血管或者加入一定量促凝劑。

2.3 檢測操作誤差： ELISA 測定基本上都是手工操作，會無可避免的存在某些誤差，如果樣品加入時間，加入試劑以及混合時間存在出入，極易造成操作時差。在操作過程中，應在加樣后輕輕混合均勻，不能混用不同批號試劑，試劑瓶和試劑蓋應仔細檢查，避免出現張冠李戴現象。應確保試劑保存的溫度、保存時間、洗滌方法、顯色條件等保持一致，在檢測時應注意避免試劑、樣本、板以及吸頭污染。若在閾值附近出現檢測結果時陰時陽現象，不要急于做出判斷，應重復多次進行檢測，最終的檢測結果應以偶數結果為判定標準。

根據以上常見問題及其原因的分析，主要存在樣本測定結果假陰性、假陽性等問題，應綜合考慮人為操作因素、試劑因素、標本因素等多方面影響，及早查明影響ELISA 測定的根本原因，并及時糾正進行重新測定，確保ELISA 測定結果的準確性、可靠性，為臨床提供科學依據。

參考文獻

[1] 譚愛華.ELISA 法檢測中應注意的問題[J].實用醫技雜志，2012，15（19）：2496.

[2] 周先碗，胡曉倩.生物化學儀器分析與實驗技術[M].北京：化學工業出版社，2012：274.