干細胞中支原體PCR檢測方法的建立

摘要：目的：為了更好的檢測干細胞中支原體污染的情況。方法：以本實驗室2013年12月-2014年4月間培養的干細胞56份為研究對象，使用PCR方法對干細胞中的支原體污染情況進行檢測，并使用支原體檢測試劑盒進行對比檢測，統計檢測干細胞中支原體污染的情況及種類。比較PCR檢測方法與支原體檢測試劑盒的準確性及特異性。結果： PCR檢測陽性例數為21例，試劑盒檢測陽性例數為12例，而陽性率分別為37.5%和21.4%。兩組間陽性例數和陽性率比較結果差異顯著（p<0.05）。復蘇的干細胞連續144小時之后，無論是PCR檢測還是試劑盒檢測，支原體的陽性例數和陽性率均高于72小時、48小時和24小時。而且在培養培養24小時或144小時之后，PCR檢測和試劑盒檢測干細胞支原體污染的陽性例數和陽性率情況比較結果差異顯著（p<0.05）。而培養48小時和72小時之后，PCR檢測和試劑盒檢測干細胞支原體污染的陽性例數和陽性率情況比較結果差異不顯著（p>0.05）。結論：PCR檢測方法較支原體試劑盒檢測方法具有更高的準確率和敏感性。

關鍵詞：支原體；干細胞；PCR檢測

【中圖分類號】

R249 【文獻標識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）07-0029-01

近些年，干細胞對治療如糖尿病、神經退行性疾病及骨關節疾病等疾病均有良好的應用評價，并且很多研究人員和普通人希望干細胞能在更多的疾病治療領域發揮更為廣闊的應用價值。人胚胎干細胞（hESCs， human embryonic stem cells）因其具有無限增殖能力和多向分化潛能而被作為研究干細胞的常用細胞類型[1，2]。細胞出現支原體污染是實驗室中比較常見的現象，感染率一般為5-30%^[3]。有研究人員的研究結果顯示，支原體污染概率與細胞傳代次數呈現正相關性。本研究對干細胞感染支原體的情況進行PCR檢測，并使用支原體檢測試劑盒進行對比檢測。

1 材料與方法

1.1 所需試劑：

PCR 預混料（購買自上海生工）；DL2000 DNAMarker（購買自北京天根生物）；瓊脂糖為BD公司；支原體檢測試劑盒（美國Lonza公司）；瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物（購買自美國Promega公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器：

PCR擴增儀（購買自美國Biometra公司）；超低溫冰箱、恒溫CO2培養箱、高速低溫離心機（購買自德國Thermo公司）；電子分析天平（購買自上海分析儀器廠）；超純水儀（購買自美國Millipore公司）；DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀（購買自北京六一儀器廠）；凝膠成像分析系統（購買自美國Bio-RAD公司）；超凈工作臺（購買自蘇州凈化設備公司）。

1.3 引物設計：

根據GenBank 收錄的支原體 Ala-PG8株、Ora-CH19299 株、Mho- BTS7株、Arg-G230 株、Fer-PG18株的序列，使用Primer5.0軟件設計引物，設計出的引物是可以擴增出以上5株支原體序列的通用引物。引物序列如下：

上游引物5’-CCAGCAGCCGCGGTATACATA- 3’

下游引物5’-GTGGACTACTAGGGTATCTAAT- 3’

1.4 干細胞的培養

1.4.1 Feeder的培養：

將本實驗室培養后凍存的人成纖維細胞進行復蘇，然后在培養皿中放置在CO2培養箱中培養，培養12h后在培養液中加入濃度為10ug/ml的絲裂霉素C，共同培養2.5h。然后使用胰酶消化人成纖維細胞加入到6孔板中，這樣就形成了Feeder。

1.4.2 干細胞的培養：

將本實驗室培養后凍存的人胚胎干細胞進行復蘇，共分7次復蘇，每次2份細胞，并且在培養24、48、72、144小時之后取細胞樣品進行PCR檢測，共計復蘇56次不同凍存批次和代數的人胚胎干細胞。將Feeder中的培養基換為人胚胎干細胞培養基，復蘇之后將細胞加入到Feeder之上，放置在4個不同的CO2培養箱中的不同位置進行培養。

1.4.3 PCR檢測：

在培養24、48、72、144小時之后取細胞樣品進行PCR檢測，首先使用移液器將培養人胚胎干細胞的6孔板中的培養基吸除，使用PBS溶液清洗一次，使用胰酶將人胚胎干細胞消化下來，使用移液器將收集的人胚胎干細胞以2500rpm離心10min，然后使用500ul 的PBS溶液重懸細胞。放置在100水浴鍋中煮沸10min，以細胞懸液10ul為模板，進行PCR擴增，擴增體系和條件見表1和表2。

PCR擴增之后，對擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳之后在凝膠成像儀下觀察并保存結果。擴增出條帶大小符合支原體DNA的為支原體污染樣品，如果沒有符合的條帶，則視為沒有支原體污染。

1.4.4 支原體試劑盒檢測： 取出1管Lonza支原體檢測瓶，在無菌超凈臺內將培養好的干細胞培養液加入到支原體檢測瓶中，蓋好檢測瓶的蓋子，放入37℃水浴鍋中1h，觀察檢測結果。

1.5 數據統計： 將所有獲得的結果使用SPSS19.0軟件進行統計，兩組之間比較采用卡方檢驗，當p<0.05時顯示比較結果差異顯著。

2 結果

2.1 支原體檢測結果： 使用兩種方法對干細胞中支原體污染的情況進行檢測，每組均檢測56例，PCR檢測陽性例數為21例，試劑盒檢測陽性例數為12例，而陽性率分別為37.5%和21.4%。兩組間陽性例數和陽性率比較結果差異顯著（p<0.05）。詳細結果見表3。

2.2 不同培養時間支原體檢測結果： 對復蘇后培養24、48、72和144小時的干細胞進行支原體檢測，結果顯示，復蘇的干細胞連續培養144小時之后，無論是PCR檢測還是試劑盒檢測，支原體的陽性例數和陽性率均高于72小時、48小時和24小時。而且在培養144小時之后，PCR檢測和試劑盒檢測干細胞支原體污染的陽性例數和陽性率情況比較結果差異顯著（p<0.05）。培養24小時之后，PCR檢測和試劑盒檢測干細胞支原體污染的陽性例數和陽性率情況比較結果差異顯著（p<0.05）。而培養48小時和72小時之后，PCR檢測和試劑盒檢測干細胞支原體污染的陽性例數和陽性率情況比較結果差異不顯著（p>0.05）。詳細結果見表4。

3 討論

一般在細胞培養的過程中，支原體污染的情況不容易被發現，因為支原體不像細菌污染一樣可以在顯微鏡下或肉眼進行觀察。但是支原體污染后會對細胞的生長，以及細胞內的基因表達及蛋白合成等反面均造成一定影響，這樣就會對科研研究結果造成一定影響^[4]。以前常用的方法是采用瓊脂培養檢測支原體，通過觀察支原體的生長特征來判斷細胞在培養過程中是否出現支原體污染的情況^[5]。但是這種經典的方法所需的時間較長。對細胞培養過程中支原體污染檢測的方法還有使用電鏡檢測、熒光染色、雙酶分析法等，但這些方法的靈敏性較低，并且操作比較復雜，檢測需要較高的費用。而PCR檢測支原體方法是近幾年得到應用的新檢測方法，PCR檢測操作簡單，所需時間較短，并且具有很高的靈敏性。

本研究中，使用PCR檢測干細胞中支原體污染情況比實驗試劑盒檢測的靈敏度高。并且檢測結果顯示，培養的時間越長，支原體污染的幾率越大。所以在干細胞培養過程中，應該對長期培養的干細胞進行相應的處理，以防支原體污染。PCR方法可以很好的檢測干細胞中支原體的存在情況。

對出現支原體污染的細胞的處理方法方法并不是很多，并不像臨床上治療支原體的方法豐富多樣[6，7]。所以在細胞培養過程中應該時刻注意支原體污染的情況。如果胚胎干細胞出現支原體污染的情況，使用抗支原體的藥物對胚胎干細胞處理之后，對支原體的生長短時間內具有很好的控制作用，但是并不能將胚胎干細胞中支原體完全清除。并且出現支原體污染的胚胎干細胞會對細胞培養室內其他細胞株造成交叉感染，如果沒有更好的處理辦法，建議將出現支原體污染的胚胎干細胞進行妥善處理或者直接丟棄。

參考文獻

[1] Lin HT， Otsu M， Nakauchi H. Stem cell therapy： an exercise in patience and prudence [J]. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci， 2013， 368（1609）：1-6.

[2] Mengarelli I， Barberi T. Derivation of multiple cranial tissues and isolation of lens epithelium-like cells from human embryonic stem cells [J]. Stem Cells Transl Med， 2013， 2（2）：94-106.

[3] Uphoff CC， Denkmann SA， Drexler HG. Treatment of mycoplasma contamination in cell cultures with Plasmocin [J]. J Biomed Biotechnol， 2012， 2012：1-8.

[4] Markoullis K， Bulian D， Holzlwimmer G， et al. Mycoplasma contamination of murine embryonic stem cells affects cell parameters， germline transmission and chimeric progeny [J]. Transgenic Res， 2009， 18（1）： 71- 87.

[5] 孫雪榮，王衛鴻，陳嘉等. Plasmocin對人胚胎干細胞支原體污染的殺滅效果[J]. 中國熱帶醫學，2013，13（7）：783- 785.

[6] Paessler， M.， A. Levinson， et al. Disseminated Mycoplasma orale infection in a patient with common variable immunodeficiency syndrome[J]. Diagn Microbiol Infect Dis， 200244（2）： 201-4

[7] Wei， W. Continuous versus intermittent azithromycin administration for treatment of Mycoplasma pneumonia-induced pneumonia： effects and drug resistance in rats [J]. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao 2008，30（8）： 1918-9， 1922