MSCs 對兔下頜骨牽張成骨處 OPG 表達(dá)的影響

摘要：目的：本實(shí)驗(yàn)通過將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）注射于兔下頜骨牽張成骨處后，了解 MSCs 對牽張成骨處促進(jìn)成骨的機(jī)制。方法：實(shí)驗(yàn)組將 MSCs 注射于右側(cè)牽張成骨處，而對照組注入等量的生理鹽水。X線圖像分析系統(tǒng)計算新生骨生成區(qū)的平均灰度值。免疫組化的方法檢測牽張成骨處新生骨組織中骨保護(hù)素的表達(dá)。結(jié)果：兔下頜骨牽張成骨實(shí)驗(yàn)動物模型造模成功，MSCs注射可促進(jìn)牽張區(qū)骨量增加，局部組織中骨保護(hù)素的表達(dá)明顯高于對照組。結(jié)論：MSCs的促成骨作用可能通過表達(dá)骨保護(hù)素來實(shí)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞：牽引成骨；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；載體；骨保護(hù)素

Abstract：

Key words：Objective： this experiment by injecting bone marrow mesenchymal stem cells （MSCs） between in rabbit mandibular stretching， understanding of MSCs to promote osteogenesis mechanism with zhang. Methods： the experimental group injected MSCs in right side with a place， and the control group into the same amount of saline. X-ray image analysis system to calculate the average grey value in new bone formation. Immunohistochemical method of detection with zhang in the expression of new bone tissue of bone protection element. Results： rabbit mandibular stretching experimental animal model building success， MSCs can promote tension zone injection increased bone mass， bone protective element in the local tissue expression is significantly higher than the control group. Conclusion： MSCs role in contributing to bone may through the expression of bone protection have achieved.

【中圖分類號】

R551.3 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）07-0009-02

牽張成骨（ distraction osteogenesis， DO）是一種內(nèi)源性骨組織工程技術(shù)，主要是通過將骨骼切開，并在切骨線兩側(cè)安放特制的牽張器，在牽張力的作用下，切骨間隙逐漸增寬，從而達(dá)到延長骨骼目的。是目前國內(nèi)外口腔頜面外科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一^[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（ Mesenehymal Stem Cell， MSCs）是一群具有多向分化潛能的干細(xì)胞，在體外特定的誘導(dǎo)條件下可以分化為骨、軟骨、神經(jīng)、脂肪、肌肉及肝等多種功能細(xì)胞。骨保護(hù)素（osteoprotegerin， OPG）是一種新的腫瘤壞死因子受體家族成員， 能夠競爭性地與核因子-kB 配體結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞活化，參與骨形成和改建，在骨的代謝平衡過程中起到極其重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過檢測骨的牽張間隙內(nèi)注射MSCs后局部組織中的OPG表達(dá)情況，進(jìn)一步闡釋其促成骨作用的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 日本大耳白兔 20只 兔下頜骨牽引器 ）、 SABC免疫組化試劑盒和 OPG多克隆抗體

1.2 兔骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定

1.3 兔單側(cè)下頜骨DO模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)動物麻醉成功后，常規(guī)皮膚消毒，暴露右側(cè)下頜體，行下頜骨切開術(shù)并將牽張器固定于口外。術(shù)后連續(xù)五天肌注青霉素，預(yù)防術(shù)后感染，流食飼養(yǎng)。經(jīng)過5天的間歇期后，以1mm/d速度進(jìn)行牽張，分2次，每次間隔 12小時，向前緩慢延長下頜骨，連續(xù)牽引5天 ，即延長下頜骨5mm后固定牽引器。

所有動物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組10只。在安裝固定牽引器后第1天，實(shí)驗(yàn)組動物麻醉后，消毒牽張區(qū)皮膚，用注射器在牽張間隙內(nèi)注入150μl MSC懸液，細(xì)胞總量約1×106，對照組注入等量生理鹽水。

1.4 牽張區(qū)新生骨量測定：保持放射條件不變：64kV，6.5mA暴光0.45秒，分別在固定期的第1天、3天、5天、7天對實(shí)驗(yàn)動物下頜骨處進(jìn)行常規(guī)攝片，觀察牽引區(qū)的新生骨的骨密度。用X線圖像分析系統(tǒng)計算牽張區(qū)新生骨的平均灰度值。

1.5 免疫組化染色法檢測 OPG 的表達(dá)：全部實(shí)驗(yàn)動物于固定期第7天麻醉下處死，取下頜骨標(biāo)本，采用SABC法嚴(yán)格按照免疫組化染色試劑盒操作說明進(jìn)行 OPG 的免疫組化染色，病理圖像分析系統(tǒng)計算牽張區(qū)OPG陽性面積的百分比。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析：計量資料用X±s表示，兩樣本t檢驗(yàn)，通過SPSS16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，* P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牽張區(qū)新生骨量的影像學(xué)觀察：如表1所示，固定期隨著時間延長，牽張區(qū)新生骨密度逐漸增加，經(jīng)過MSCs注射的實(shí)驗(yàn)組新生骨灰度值較對照組增加明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組牽引成骨區(qū)新生成骨的平均灰度值（X±S，n=10）

*表示該組與對照組比較有顯著性差異（P<0.05）

2.2 OPG在牽張區(qū)骨組織中的表達(dá)：免疫組化染色結(jié)果顯示OPG主要位于牽張成骨區(qū)處成纖維細(xì)胞，新生骨小梁周圍的成骨細(xì)胞附近。陽性表達(dá)表現(xiàn)為胞漿組織內(nèi)有棕黃色顆粒，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核為藍(lán)紫色。實(shí)驗(yàn)組牽張區(qū)OPG表達(dá)明顯高于對照組，如表2所示。

3 討論

牽張成骨術(shù)一般都會有一個延遲期，即從手術(shù)結(jié)束到開始牽引的這一段時間。在牽引期中，最為重要的因素為選擇牽引的速率和頻率。Ilizarov等^[1]人發(fā)現(xiàn)：以每天1.0mm的牽張速度行連續(xù)牽引能夠取得最佳成骨效果。這種觀點(diǎn)得到了后來Meyer等^[2]和Carl等^[3]等人的研究所支持。此外Ilizarov等人嘗試采用每天2.0mm速度牽引， 4周后發(fā)現(xiàn)，斷端大部分被結(jié)締組織所填充，從而進(jìn)一步說明以上觀點(diǎn)。這些研究成果為牽引成骨技術(shù)的臨床應(yīng)用奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。我們可以利用骨髓間質(zhì)干細(xì)胞局部注射于牽張成骨處促進(jìn)骨組織及周圍組織愈合這一特點(diǎn)，將骨髓間質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于臨床中去，提高骨愈合的能力，減少牽張成骨術(shù)帶來的痛苦，縮短療程。

表2 兩組牽引成骨區(qū)OPG表達(dá)的比較（X±S，n=10）

參考文獻(xiàn)

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