微生物實驗室定量質控樣品的制備與均勻性研究

摘要： 目的：制備微生物定量質控樣品，并對樣本的穩定與均勻性進行檢測分析，判斷是否符合日常工作室內質控的要求。方法：將一定濃度的甘油-營養肉湯菌懸液快速凍存于液氮中。對短期內凍存樣品連續隨機抽取10個樣，進行菌落總數的檢測。應用單因素方差分析法對檢測結果進行統計分析。結果：以α=0.05為檢驗水準，該質控樣樣品間無顯著性差異（P=0.159）。結論： 樣品短期內具均勻性和一定穩定性。該質控樣品，可對微生物實驗室定量檢測的短期質控提供一定的幫助

關鍵詞：： 均勻性；質量控制；微生物

【中圖分類號】R155【文獻標識碼】A【文章編號】1672-8602（2014）02-0017-02

在微生物學定量檢驗領域，由于其檢驗對象的特性，日常工作的過程質控，因缺乏高可信度、價格優廉的標準物質，往往只能通過培養基、培養溫度、培養時間等的檢查來確定檢驗過程的可控性，但有時人員或其它因素變化可給檢測結果帶來一定的隨意性和不確定性。同時或因不能及時發現過程失控而忽略，或因對檢測過程懷疑而使結果的可信度降低，從而無法保證檢測質量。因此，制備達到一定均勻性與穩定性的微生物定量質控樣品，可促進日常工作的檢測過程質量控制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品：實驗室自備樣品，為含一定量菌落數的甘油-腦心浸出液。凍干菌株：金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003（來源：中國食品藥品檢定研究院）。

1.1.2 主要儀器與試劑：（1）主要儀器：BLON-08型均質器，立式高壓滅菌鍋，DHP-9160恒溫培養箱，BHC-1300IIA2生物安全柜、YDS-30-125液氮罐。（2）主要試劑：甘油、氯化鈉（均為廣東汕頭化工廠生產），營養肉湯、平板計數瓊脂培養基、腦心浸出液（均為北京陸橋技術有限責任公司生產）；所有試劑按其相應要求制備與滅菌，均在有效期內使用。

2.2方法

2.2.1樣品制備： 取凍干菌株，按要求加入一定量營養肉湯在（36.0±0.5）℃（24±2）小時復蘇。分別取復蘇液1ml加入60ml營養肉湯中，（36.0±0.5）℃（24±2）小時。分別取該培養液按GB4789.2-20l0菌落總數[1]檢驗其所含菌落數，同時該培養液置于4℃冰箱中。之后將該培養液用4℃的甘油-營養肉湯稀釋至含菌落為6000～10000CFU/ml的菌懸液，將該菌懸液分裝于凍存管中，2.2ml/管，作為凍存樣品。快速依次置于液氮氣層、液氮中凍存。

2.2.2操作步驟：菌落總數：對凍存的樣品每日隨機抽取1個樣品進行檢測、共10個[2]。樣品取用時，將凍存管快速置于37℃溫水中，1分鐘內快速解凍。無菌條件下將樣品開啟、取樣，每份樣品進行平行試驗。所有測試均應在可重復條件下進行。對所取樣品，分成2份，并進行3個系列的10倍倍比稀釋，混合均勻，按4789.2-2010操作，分別吸取各稀釋液1mL到2個平皿中，傾入保溫為45℃的平板計數瓊脂，混勻，待培養基凝固后倒置放于36℃恒溫培養箱中48h培養，取出平板進行菌落計數。同時分別以稀釋液和培養基做空白對照。

2.2.3均勻性檢驗：可以通過檢驗各樣本均值是否具有統計學意義上的差異來判斷制備樣品的均勻性，常采用單因素方差分析法、t檢驗法、極差檢驗法等統計學方法[3-4]。對生物類樣品可采用單因素方差分析 （one-way ANOVA）來進行樣品均勻性的統計分析判斷[4]。單因素方差分析（one-way ANOVA）又稱為一維方差分析，研究單個因素對觀測變量的影響，對由單一因素影響的一個（或幾個相互獨立的）因變量由因素各水平分組的均值之間的差異進行檢驗，判斷是否具有統計意義。因此，若各分組間存在統計學差異，說明該因素（分類變量）對因變量存在顯著影響。 計算公式見表1。

3結果

單因素方差分析結果見表2。檢測結果見表3，

4討論

為適應隨著人民生活水平的提高及技術水平的發展，相關產品細菌學指標檢測標準或方法不斷得到提高與完善，由此對微生物實驗室的檢測質量控制提出的要求也越來越嚴謹與細致[5]。目前，為確保實驗室檢測能力與質量控制，主要途徑是除了定期參加相關項目的實驗室能力驗證外，在細菌學指標檢測的日常工作中，需要對培養基進行適應性與對照菌株的生長能力檢查，實驗過程帶入陽性對照、空白對照或陰性對照，對實驗環境的潔凈程度進行定期監測與控制，對其它實驗條件如溫度、時間等進行控制，同時不斷加強技術人員的專業技能培訓[5-9]。若是能在日常工作中的定量檢測實驗過程帶入定量質控樣品，則可以從另一個方面反映實驗室的檢測質量，尤其在實驗條件發生改變而又未能及時發現時可以發出警示，同時對不同檢測技術人員的檢測過程起到一個平行對照的作用，也有助于評定實驗室的不確定度。其不隨檢測人員、日常檢測樣品等的改變而受到影響。目前已出現商品化的定量質控樣品，也有獲得國家批準成為標準物質的，但作為日常工作的質控樣品，需要考慮到成本因素。因此，制備實驗室日常工作質控樣品，具有重要的意義。

通過隨機抽樣，采用單因素方差分析法對短期保存的10個樣本進行統計分析，樣品內和樣品間均無顯著性差異，由此可初步說明該樣本是均勻的。要注意的是在檢測前對所用培養基進行適應性檢查，所用菌株具有良好的活性；檢測過程中取樣量需準確、取樣方式、測定方法具備一定的平行性，防止各稀釋度交叉污染等。此次樣本為單一菌株是日常工作定量質控的初步探索。作為菌落總數檢驗的過程質控，混合菌株的質控樣更具代表性。但由于不同細菌的特性不同，在相同培養基與培養條件下的生長情況體現差異，在混合生長時可能存在一定的相互作用或影響及其程度的大小[10]、在保存及定量檢測時是否能夠表現出一定規律尚不能完全確定，對樣本的均勻性產生一定的影響，而混合多少種菌株作為質控品，對菌落總數指標才具代表意義，尚需要不斷摸索、改進與完善。

參考文獻

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