牡丹紅斑病病原鑒定與ITS序列分析

石良紅等

摘 要：牡丹紅斑病是危害牡丹的最重要病害之一。本研究欲通過對病原菌進行鑒定并明確其分類地位。采用形態(tài)學方法結合分子標記法對牡丹紅斑病病原進行鑒定，利用Mega5軟件對枝孢霉屬進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。結果表明：該病致病菌為牡丹枝孢霉，序列與GenBank登錄號為GQ395812.1的ITS序列同源性最高，同源性大于99%。聚類分析發(fā)現(xiàn)，枝孢霉屬可分為7個聚類組，樣品菌株與牡丹枝孢霉為一類。分子鑒定與形態(tài)學鑒定結果一致，該研究為牡丹紅斑病的快速診斷與防治提供了依據(jù)，并為枝孢屬的系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定提供了參考。

關鍵詞：牡丹紅斑??；枝孢霉；ITS序列分析；系統(tǒng)發(fā)育樹

中圖分類號：Q945.8 文獻標志碼：A 論文編號：2014-0024

Abstract： The red spot was one of the most important diseases which harms peony tree. The aim of the research was to clarify its taxonomic status by identifying the pathogen of tree peony leaf spot. In this study， the pathogen was identified based on morphology and molecular identification， the ITS phylogenetic trees of Cladosporium spp. was generated with the soft of Mega 5. The result suggested that the pathogen of tree peony leaf spot was Cladosporium paeoniae， and its sequences had the highest homology with GQ395812.1 in GenBank， whose homology was greater than 99%. Cluster analysis suggested that the Cladosporium spp. could be divided into 7 groups. Samples strains and Cladosporium paeoniae belonged to a class. The molecular identification and morphology identification researched the same results. This paper provided the reference for the rapid diagnosis and prevention of tree peony red spot disease， and the information for phylogenetic and taxonomic identification of Cladosporium spp..

Key words： Tree Peony Red Spot； Cladosporium； Analysis of ITS Sequence； Phylogenetic Tree

0 引言

牡丹紅斑病又稱牡丹葉霉病，是中國牡丹產區(qū)的重要病害之一。此病主要危害牡丹葉片，也侵染葉柄、嫩枝、花器[1]。近年來，牡丹紅斑病在牡丹產區(qū)發(fā)生普遍，危害嚴重，常導致葉片早枯，嚴重影響植株的生長和花芽分化，是生產實際中急需解決的問題。

目前，對牡丹紅斑病的研究主要為其發(fā)病規(guī)律、藥劑防治試驗、病原的形態(tài)和致病性鑒定等。然而傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定方法研究病原菌多樣性存在工作量大、重復性差等缺點[2]。隨著分子生物學的發(fā)展，人們開始利用分子標記方法來鑒定病原菌種類。該方法可用于真菌屬、種水平的分類，其序列差異有助于相似種的鑒別[3]。ITS區(qū)（internal transcribed space）是介于18SrDNA、5.8SrDNA和28SrDNA之間的區(qū)域[4]，該區(qū)域進化速度較編碼區(qū)快，在種內不同菌株間高度保守，通過與數(shù)據(jù)庫中與同源序列進行比較來確定其種屬關系[5-6]。國內外對該方法的采用主要集中在疫霉菌（Phytophthora）、銹菌（Puccinia）、炭疽菌（Colletotrichum）和鐮刀菌（Fusarium）等，但是對枝孢霉的研究相對較少[7]。唐建輝等[8]根據(jù)通用引物ITS1和ITS4擴增出西瓜炭疽病菌的ITS區(qū)段，對炭疽屬24個種進行聚類分析研究了炭疽屬的系統(tǒng)發(fā)育。陳玉璽等[9]通過對分離到的鐮刀菌菌株進行ITS序列測定，構建了相關菌株的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹。Gardes[10]以ITS片段為模板，合成了多種引物，其中ITS1-F對真菌有很高的特異性，ITS4-B對擔子菌的特異性很高。Curtis等[11]通過對來自不同地區(qū)的番茄葉霉病菌ITS序列進行分析比較，鑒定了番茄葉霉病原并證明該病菌種內保守。本研究以傳統(tǒng)的形態(tài)學特征為基礎，對牡丹紅斑病病原菌的rDNA-ITS序列進行分析和比對，進而從分子水平上明確牡丹紅斑病的病原菌類型。以期加深前人對枝孢霉的研究，快速準確的檢測牡丹紅斑病，并為該病的防治和抗性品種選育研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

研究田間試驗于2013年在山東農業(yè)大學牡丹種種質資源圃進行，室內試驗在山東農業(yè)大學林學院花卉研究實驗室進行。牡丹紅斑病的病葉采自山東農業(yè)大學牡丹種種質資源圃發(fā)病嚴重的牡丹植株。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離和純化 采用常規(guī)的組織分離法進行分離純化，將明顯帶有牡丹紅斑病病癥的病葉用10%的次氯酸鈉消毒后切去病健交界處組織分別接種到PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)，待菌落長出后進行純化[6]，一個月后保存于4℃冰箱中備用。

1.2.2 形態(tài)學鑒定 對分離后得到的菌落在25℃下進行恒溫培養(yǎng)。對其培養(yǎng)特征和形態(tài)特征進行觀察并記錄，以確定其種屬地位。培養(yǎng)特征主要包括菌落形狀、生長速度、菌落表面特征、菌落邊緣特征、菌落質地、顏色等。形態(tài)特征的觀察在電子顯微鏡下進行，主要包括菌絲體大小、形狀、表面特征及孢子大小、形狀、類型、顏色等[11]。

1.2.3 致病性鑒定 將分離到的牡丹紅斑病病原菌的分離物在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，溫度25℃，直至菌落產生分生孢子。用滅菌的蒸餾水配制孢子懸浮液，在牡丹種植基地取健康的牡丹幼葉，75%酒精消毒，無菌水沖洗后晾干備用。滅菌的培養(yǎng)基中，鋪一層滅菌的濾紙，加入滅菌的去離子水和經(jīng)處理的牡丹葉片，用配置好的孢子懸浮液進行針刺接種，同時設置接種無菌水作為對照。按照柯赫氏法則，將接種后發(fā)病的葉片重新分離純化，看分離得到的菌物是否與接種菌株相一致[12]。

1.2.4 分子生物學鑒定 采用改良的CTAB法提取菌株的DNA，進行PCR擴增測序。PCR擴增采用真菌通用引物ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGCGG-3）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3），由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。其中ITS1位于18S rDNA的末端，而ITS4位于28S rDNA的起始部位。PCR采用25 ?L反應體系：2×Es Taq MasterMix 12.5 ?L，菌株總DNA 2 ?L，引物ITS1和ITS4各2 ?L （10 ?mol/L），ddH2O 6.5 ?L。PCR反應條件：預變性94℃ 5 min；變性94℃ 45 s，退火55℃ 45 s，延伸72℃ 105 s，35個循環(huán)；補平72℃ 10 min，4℃ 5 min[13-14]。PCR擴增產物于的1%的瓊脂糖凝膠上電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)上檢測并記錄擴增產物在瓊脂糖凝膠上的圖譜。利用Axy PrepDNA凝膠回收試劑盒回收DNA片段，回收產物送由上海桑尼生物科技有限公司測序。測序的結果與GenBank中查到Cladosporium屬的23個種的序列進行同源性分析，利用Mega5軟件中鄰接法（neighbor-joining methods，NJ）構建聚類分析樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學鑒定

病株在PDA培養(yǎng)基上分離純化后，形成墨綠色霉層，菌絲較短，生長比較緩慢，菌落背面星裂狀。顯微鏡下觀察病原菌，分生孢子大部分為橢圓形，大小不一，頂生，形成孢子鏈，分生孢子梗3～7根簇生，2～6個分隔。對照陸家云和張中義方法[15-16]，鑒定該病原菌為牡丹枝孢霉。

2.2 致病性鑒定

將孢子懸浮液進行針刺接種7天后，可發(fā)現(xiàn)牡丹枝孢霉對接種的品種均具有致病性，而對照組沒有發(fā)病。發(fā)病葉片出現(xiàn)紅褐色斑點，然后病斑慢慢擴大，顏色加深，變?yōu)樽虾稚?，后期出現(xiàn)墨綠色霉層。將接種后發(fā)病葉片的病斑進行分離培養(yǎng)，得到的菌株與接種的菌株形態(tài)與生理特性一致。

2.3 分子生物學鑒定

2.3.1 擴增結果分析 利用改良的CTAB法可以得到菌株的基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測，DNA的質量符合實驗要求。以得到的DNA為模板，進行PCR擴增，得到長度約為580 bp左右的DNA片段，結果如圖1所示。將得到的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳后，用試劑盒將膠進行回收測序的結果與GenBank中查到與牡丹枝孢霉登錄號為GQ395812.1的ITS序列同源性最高，同源性大于99%。根據(jù)認證，真菌ITS區(qū)域比對，序列相似性大于99%，鑒別為同種[17]，鑒定該菌株為牡丹枝孢霉。

2.3.2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析 將測得的序列與在GenBank數(shù)據(jù)庫中查到Cladosporium屬的23個種，利用Mega5軟件中鄰接法（neighbor-joining methods，NJ）構建聚類分析樹狀圖。如圖2所示，可將枝孢霉屬分為7個聚類組，樣品與牡丹枝孢霉的同源性最高，聚為一組，此外與C.lignicola和C.delicatulum的親緣關系相對較近。

3 討論與結論

傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定病原真菌不僅工作量大、耗時長，并且結果準確性差。ITS序列分析可以準確地反映出屬間、種間以及菌株間的堿基對差異，不僅解決了傳統(tǒng)鑒定過程中的缺點，并為快速準確的鑒定植物病原提供了分子方面的依據(jù)。本研究通過對牡丹紅斑病原的ITS序列分析，快速鑒定了牡丹紅斑病的病原菌致病菌。通過致病菌株ITS的PCR擴增與序列測定，利用Mega5軟件構建與GenBank中登錄Cladosporium屬的23個種的聚類分析樹狀圖，表明該菌株與GenBank中登錄的Cladosporium paeoniae之間高度同源，大于99%，同時與C. lignicola和C. delicatulum的親緣關系相對較近。結果證明牡丹紅斑病的致病菌為牡丹枝孢霉，與季延平等[1]的形態(tài)學鑒定結論相一致。由于國內外對枝孢霉的研究較少，本試驗通過結合分子標記方法鑒定了牡丹紅斑病的病原菌，并對其屬內系統(tǒng)發(fā)育和分類狀況做了探討分析，對牡丹紅斑病的快速診斷和抗病品種的選育具有一定意義，同時為牡丹枝孢霉的分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育等研究提供了一定的依據(jù)和資料。

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