蘭屬品種間遺傳多樣性的AFLP分析

王曉英 王長憲

摘 要：為從分子水平上研究蘭屬植物的遺傳多樣性和建立適合的分子標記反應體系。本研究采用AFLP分子標記技術，對蘭屬植物的9個品種進行了遺傳多樣性分析。結果表明，篩選得到的8對引物共擴增出965條DNA片段，其中多態性條帶為931條，平均1對引物擴增條帶121條（多態性帶116條），多態性位點頻率為95.87%，說明遺傳多樣性豐富。用NTSYS2·10進行UPGMA聚類分析，屬于同種的品種聚在一起，與表型分類基本吻合。蘭屬植物間遺傳相似系數變化范圍為0.416～0.606。此分子標記技術體系可為蘭屬分類及種質遺傳多樣性分析提供技術依據。

關鍵詞：蘭屬；品種；AFLP；遺傳多樣性

中圖分類號：S682.31 文獻標志碼：A 論文編號：2014-0113

Abstract： The aim was to analyze genetic diversity of Cybidium and establish suitable reaction system from the molecular level. The genetic diversity and relationship of 9 cultivars of Cymbidium were evaluated using AFLP molecular markers in this study. Among the 965 AFLP bands obtained from eight selective primer pairs， 931 （95.87%） were polymorphic. The average number of DNA bands per primer pair was 121，and the average number of DNA polymorphic bands per primer pair was 116. Using NTSYS2·10 to UPGMA cluster analysis， cultivars originated from the same species could be clustered together in the AFLP dendrogram and this division was in consistence with the morphological classification. Genetic similarity among the cultivars ranged from 0.416 to 0.606. The reaction system of AFLP could be used to the classifying of Cybidium and the analysis of its germplasm genetic diversity.

Key words： Cybidium； Cultivar； AFLP； Genetic Diversity

0 引言

蘭屬（Cymbidium）是蘭科的樹蘭亞科的一個屬，全世界約有蘭屬植物55種，主要分布于亞洲熱帶與亞熱帶地區，向南到新幾內亞島和澳大利亞。中國有49種蘭屬植物和一些變種，產于秦嶺以南各省[1]，中國人傳統上所說的蘭花，大都是指蘭科蘭屬中的地生蘭類植物，具有重要的藥用價值和觀賞價值[2-3]。

傳統的蘭屬植物分類和品種鑒定常常以花和葉的形態特征為依據，結果往往受到生長環境和發育階段的限制。由于各種變種以及自然雜交種的存在，僅憑植株的形態特征進行蘭花種質鑒定較為困難，這對蘭花品種研究產生了不利影響。DNA分子標記技術以遺傳物質為依據，從基因水平直接反映種間和種內差異，突破以往用傳統方法分類鑒定的局限性，直接在物種基因組DNA水平上顯示遺傳多樣性，為分類鑒定提供了高效準確的方法。

AFLP是新發展起來的一項檢測DNA多態性技術，它從原理上結合了RFLP和RAPD的優點，具有高分辨率、高重復性、高靈敏度和共顯性等特點，通過對基因組DNA的限制性酶切片段進行選擇性擴增而揭示多態性[4-5]。AFLP標記技術已經在DNA指紋圖譜繪制、品種鑒定、遺傳多樣性分析及基因定位等方面得到了廣泛應用[6]。目前，已用于蘭屬植物的分子標記技術有RAPD[7-9]、ISSR[10-12]和SRAP[13-14]，利用AFLP分子標記技術對蘭屬植物遺傳多樣性研究較少且技術體系存在差異[6，15]，本實驗以9個蘭屬品種為研究材料，利用AFLP技術進行遺傳多樣性分析，擬建立適合蘭屬植物的AFLP分子標記反應體系，為蘭屬植物遺傳多樣性研究及新種的選育提供分子水平的技術依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試材料為蘭屬（蓮瓣蘭、建蘭、春蘭和春劍）的9個品種（表1），由泰安市泰山林業科學研究院蘭花種質資源圃提供。

1.2.5 凝膠分析 選擇性擴增產物和上樣緩沖液比例為8：3，渦旋混勻，95℃變性，8 min后，立即冰浴，取4 μL上樣到ABI377測序儀，進行4%聚丙烯酰胺凝膠電泳，室溫下電泳2.4 h，自動采集原始膠圖。對照（Marker）為ROX500分子量內標。電泳結束后用Genescan3.1從原始膠圖中提取數據，然后用Binthere將片段的大小提取出來，再用Excel將數據轉換成0和1數據，用Popgene和Ntsys2·10進行多態性和聚類分析。用Max comp程序對聚類結果和相似系數矩陣之間的相關性進行Mantel檢驗。

2 結果與分析

2.1 引物篩選和多態性分析

通過對64對AFLP引物的篩選，篩選出了8對多態性較強且擴增產物清晰的引物組合（表2）。8對引物共擴增條帶965條，其中多態性帶931條；平均1對引物擴增條帶121條，其中多態性帶116條，多態百分比為95.87%。8對引物組合均能揭示DNA多態性，其中引物HindIIIAAC/MseI CTC擴增出多態性條帶最少為100條，多態性比例為98.04%，HindIIIAGC/MseI CTC擴增的多態性帶最多為132條，多態性比例為97.06%，表明蘭屬植物具有豐富的遺傳多態性。

2.2 凝膠分析

AFLP擴增產物長度介于70～500 bp之間，其中引物HindIIIAGC/MseI CTT的聚丙烯酰胺凝膠電泳結果見圖1，結果條帶清晰，該引物共擴增出132條帶，其中多態性帶125條，占94.7%，說明上述體系可用于蘭屬植物的AFLP分析。

2.3 聚類分析

基于AFLP的擴增結果，用NTSYS2·10進行UPGMA聚類分析，得到蘭屬植物品種親緣關系樹狀圖（圖2）。將聚類結果進行Mantel檢驗，相關系數為0.8219，達到極顯著水平，表明聚類結果很好地體現了蘭屬植物品種間的親緣關系。由AFLP技術得到的聚類圖將9個品種共分為4個部分，屬于同種的品種聚在一起，與表型分類基本吻合，如春蘭品種集圓、萬字和宋梅聚在一起，建蘭品種地荷、神童冠、小天龍和綠梅也聚在一起。聚類結果表明AFLP技術可將種內的品種完全區分開。總之此技術體系可以很好地揭示供試蘭屬植物種間和種內的遺傳差異和親緣關系。

9個品種間遺傳相似系數變化范圍為0.416～0.606。‘小天龍和‘綠梅間相似系數最高，為0.606，說明具較高的同源性。‘荷型素與其他供試品種的遺傳相似系數都較小，與‘萬字的相似系數最小，為0.416，說明‘荷型素與‘萬字間的遺傳距離較遠。

3 結論與討論

前人利用AFLP技術對蘭屬植物進行遺傳多樣性研究的酶切體系均采用EcoRI/MseI[6，16-17]和PstI/MseI[15]，而本實驗條件下，HindIII/MseI體系能夠得到清晰、穩定和多態性豐富的指紋圖譜，DNA分子水平上的多態性可對蘭屬植物進行遺傳多樣性分析，通過聚類分析可區分蘭屬植物，完善和補充了蘭屬植物分子標記反應體系，是一種適于蘭屬親緣關系及遺傳多樣性分析的方法。

謝偉等[7]和梁紅健等[18]認為蓮瓣蘭與春蘭、建蘭是平行關系，而本實驗結果表明蓮瓣蘭品種與春蘭品種的親緣關系較近，這與陳心啟等[2]和孫彩云等[19]的研究結果基本相符；本實驗結果表明春劍品種和春蘭品種親緣關系較遠，與吳應祥[20]觀點一致，而陳心啟等[2]認為春劍是春蘭的一個變種。總之，蘭屬種間和種內分類存在分歧，有待進一步深入研究，對蘭屬種質資源保護與新品種開發都有重要意義。

參考文獻

[1] 陳心啟. Flora of China[M].第25卷北京：科學出版社，2009：260.

[2] 陳心啟，吉占和.中國蘭花全書[M].北京：中國林業出版社，1998：96-97.

[3] 陳心啟.中國植物志[M].第18卷.北京：科學出版社，1999：191-227.

[4] Zabeau M， Vos P. Selective restriction fragment amplification， a method for DNA fingerprinting[P]. European Patent Application 94202629.7 （publication No. 05348AI）. Paris： European Patent Office，1993.

[5] Vos P， Hogers R， Bleeker M， et al. AFLP： a new technique for DNA fingerprinting[J]. Nucleic Acids Research，1995，23（21）：4407-4414.

[6] 陳惠云，孫志棟，孫日飛，等.AFLP分子標記技術在名貴春蘭鑒別中的應用[J].中國農學通報，2007，23（2）：70-73.

[7] 謝偉，樂超銀，林直.蘭屬品種的RAPD鑒定和親緣關系分析[J].江蘇農業學報，2005，21（4）：369-373.

[8] 明鳳，董玉光，婁玉霞，等.蝴蝶蘭不同花色品種遺傳多樣性的RAPD分析[J].上海農業學報，2003，19（2）：44-47.

[9] 季祥彪，王國鼎，喬光.貴州野生春蘭遺傳多樣性的RAPD分析[J].華中農業大學學報，2008，27（2）：297-302.

[10] 高麗，楊波.春蘭ISSR-PCR反應體系的優化[J].華中農業大學學報，2006，25（3）：305-309.

[11] 高麗，楊波.湖北野生春蘭資源遺傳多樣性的ISSR分析[J].生物多樣性，2006，14（3）：250-257.

[12] 吳振興，王慧中，施農農，等.蘭屬Cymbidium植物ISSR遺傳多樣性分析[J].遺傳，2008，30（5）：627-632.

[13] 馬紅勃，賴鋆英，許旭明，等.基于SRAP標記的大花蕙蘭種質資源遺傳多樣性分析[J].植物遺傳資源學報，2011，12（4）：551-556.

[14] 周艷霞，尹俊梅，任羽，等.文心蘭種質遺傳多樣性的SRAP分析[J].熱帶農業科學，2009，29（7）：43-46.

[15] 朱根發，李冬梅，郭振飛.大花蕙蘭遺傳多樣性及親緣關系的AFLP分析[J].園藝學報，2007，34（2）：417-424.

[16] 王慧中，王玉東，周曉云，等.蘭屬14種植物遺傳多樣性RAPD及AFLP分析[J].實驗生物學報，2004，37（6）：482-486.

[17] 張俊祥，李枝林，范成明，等.云南野生蘭屬主要種間親緣關系的AFLP分析[J].園藝學報，2006，33（5）：1141-1144.

[18] 梁紅健，劉敏，張純花，等.中國蘭花部分品種的葉片同工酶分析[J].實驗生物學報，1997，30（3）：343～348.

[19] 孫彩云，張明永，梁承鄴，等.墨蘭、春蘭變種和品種間同工酶分析[J].園藝學報，2002，29（1）：75-77.

[20] 吳應祥.中國蘭花[M].北京：中國林業出版社，1993：31-45.