一種改進(jìn)的自體表皮細(xì)胞懸液制取方法

趙洪良 趙連魁 李冬軍 鄭文立 楊高松 李明

[摘要]目的：探討新的自體表皮細(xì)胞懸液制取方法。方法：選取30只大鼠，應(yīng)用切削皮法結(jié)合胰蛋白酶和組織微粒法結(jié)合中性蛋白酶/胰蛋白酶法兩種技術(shù)獲得自體表皮細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞產(chǎn)量和活力的比較。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組整個(gè)操作約1h內(nèi)即可完成，而對照組則需要1.5天的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞率0.966±0.35，對照組活細(xì)胞率0.971±0.42，兩組間比較無明顯差異（P>0.05）。細(xì)胞產(chǎn)量：實(shí)驗(yàn)組（1.5±0.52）×106，對照組（1.9±0.72）×106，兩組間比較有無差異（P>0.05）。結(jié)論：切削皮法結(jié)合胰蛋白酶法制取表皮細(xì)胞懸液，制取的表皮細(xì)胞懸液的產(chǎn)量和活力與組織微粒法結(jié)合中性蛋白酶/胰蛋白酶法比較無顯著差異，但操作簡單和耗時(shí)少。

[關(guān)鍵詞]表皮細(xì)胞；懸液；細(xì)胞活力； 胰蛋白酶

[中圖分類號]R62 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號]1008-6455（2014）19-1615-03

自體皮片移植是皮膚創(chuàng)面修復(fù)的重要手段，供皮區(qū)的瘢痕、感染和色素異常并發(fā)癥的難題一直未得到解決，尤其大面積深度燒傷患者因?yàn)楣┢^(qū)域限制等問題，促進(jìn)了自體表皮細(xì)胞懸液的出現(xiàn)，并開始應(yīng)用于創(chuàng)面治療，但是臨床應(yīng)用效果不佳[1]。1975年培養(yǎng)自體表皮細(xì)胞成功[2]，由于培養(yǎng)的自體表皮細(xì)胞不但需要2周左右實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)時(shí)間，而且需要昂貴的實(shí)驗(yàn)室和技術(shù)熟練的專業(yè)人員，最重要的是經(jīng)過培養(yǎng)的表皮細(xì)胞成功移植后存在組織脆弱，抗感染能力差等問題，所有這些缺陷限制了其臨床應(yīng)用[3-4]。因此開發(fā)一種技術(shù)簡單，耗時(shí)少、產(chǎn)量高和活力好的自體表皮細(xì)胞懸液制取方法是燒傷和整形外科的研究熱點(diǎn)。本研究對切削皮結(jié)合胰蛋白酶法和組織微粒結(jié)合中性蛋白酶/胰蛋白酶法兩種技術(shù)獲得自體表皮細(xì)胞懸液進(jìn)行了比較，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1動(dòng)物與分組：選取成年健康 Wistar 大鼠 30 只，體重200～300g，雌雄各半，術(shù)前禁食6h，予以10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉（供皮區(qū)選擇正常的背部兩側(cè)皮膚，固定好大鼠，消毒后，刮除背部鼠毛，形成約2cm×2cm無毛區(qū)，周圍用膠帶粘貼。用碘伏常規(guī)消毒正常皮膚3次，設(shè)計(jì)切取皮片范圍1.0cm×1.0cm，皮下注射生理鹽水使供皮區(qū)皮膚明顯腫脹并形成一個(gè)相對的平面，取無菌一次性剃須刀片，中號直血管鉗夾刀片，切下表皮，取皮片的厚度在切削時(shí)應(yīng)密切觀察。或者輥軸取皮刀切取刃厚皮片，取下的皮片立即放于生理鹽水浸洗3遍備用，供皮創(chuàng)面，無菌凡士林油紗覆蓋，無菌敷料加壓包扎。

1.2酶消化：實(shí)驗(yàn)組：無菌條件下，將浸洗后皮片放入無菌容器中，組織剪簡單剪碎皮片至1.0mm×1.0mm，加入適量無菌0.125%胰蛋白酶/0.01%EDTA溶液，37℃消化20min后，無菌條件下離心收集上層表皮細(xì)胞懸液。對照組采用，無菌皮片浸于Dipase I 溶液，4℃消化過夜，鑷子分離表皮細(xì)胞，生理鹽水漂洗3遍，0.25%胰蛋白酶和 0.01% EDTA混合液，37℃消化10min，吸管反復(fù)吹打分散細(xì)胞，收集表皮細(xì)胞懸液[5]。

1.3細(xì)胞活力測定：細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液以9：1混合混勻。在3min內(nèi)，分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。OlympusIX71倒置顯微鏡鏡下觀察，死細(xì)胞被染成明顯的藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染呈無色透明狀。血球計(jì)數(shù)板法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞活力：活細(xì)胞率（%）= 活細(xì)胞總數(shù)/（活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，兩組設(shè)計(jì)的計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分率表示，率的比較采用 χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1無菌條件下，實(shí)驗(yàn)組整個(gè)操作約1h內(nèi)即可完成，而對照組則需要1.5天的時(shí)間，所獲得的表皮細(xì)胞懸液中均含有表皮細(xì)胞，黑色素細(xì)胞和朗罕氏細(xì)胞。

2.2細(xì)胞活力：實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞率0.966±0.35，對照組活細(xì)胞率0.971±0.42， 兩組間比較無明顯差異（P>0.05，如圖1）。

4.3 細(xì)胞產(chǎn)量：實(shí)驗(yàn)組（1.5±0.52）×106，對照組（1.9±0.72）×106，兩組間比較有無差異（P>0.05，如圖2）。

3 討論

表皮細(xì)胞懸液不僅可用于創(chuàng)面治療，而且應(yīng)用于白癜風(fēng)等皮膚疾病的治療，因此制取表皮細(xì)胞懸液的方法相關(guān)研究是燒傷和整形外科研究熱點(diǎn)之一。綜合文獻(xiàn)報(bào)道的制取方法，目前主要步驟包括：取皮，剪碎，酶消化和獲得表皮細(xì)胞懸液[4-6]。

首先，取皮方法主要有負(fù)壓取皮，剃須刀切削法取皮，輥軸刀或者電動(dòng)取皮刀取皮，手術(shù)刀切取全厚皮等。負(fù)壓取皮法盡管損傷小，但是操作復(fù)雜，耗時(shí)長，并且移植后表皮細(xì)胞總成活率低，是因?yàn)樨?fù)壓吸皰對表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞的生理功能造成了一定的影響，影響了移植后細(xì)胞的存活[7]。至于手術(shù)刀切取全厚皮，損傷重以及不適合大面積取皮等缺點(diǎn)而限制了其的應(yīng)用。而應(yīng)用切削法直接切下薄層表皮，表皮細(xì)胞的各種生理功能并未受到影響，而且操作時(shí)間短。故本研究中采用該方法順利取得皮膚標(biāo)本，但操作過程中都要注意掌握深度，表皮移植術(shù)后應(yīng)盡量減少運(yùn)動(dòng)，以免影響表皮細(xì)胞的成活。

其次，酶消化技術(shù)。中性蛋白酶結(jié)合胰蛋白酶二步法是獲得培養(yǎng)表皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室常用的方法，該方法需要在特定的細(xì)胞培養(yǎng)間首先用中性蛋白酶分離表皮和真皮，這個(gè)過程需要一個(gè)較長的時(shí)間，然后用胰蛋白酶消化表皮后即可得到表皮細(xì)胞懸液。該方法對實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備和人員要求較高，操作步驟復(fù)雜，耗時(shí)長，在臨床應(yīng)用受到很大的限制，此外，該產(chǎn)品價(jià)格昂貴限制了臨床應(yīng)用。

Recell技術(shù)是近年來出現(xiàn)的新方法之一[8]，該方法是消化表皮真皮連接區(qū)的真皮面的表皮細(xì)胞制取懸液應(yīng)用于臨床，僅僅只獲取了標(biāo)本中一部分有活性的細(xì)胞成分，制取表皮細(xì)胞懸液，浪費(fèi)了較多的皮膚標(biāo)本，本研究改進(jìn)了表皮細(xì)胞懸液的制取方法，利用組織剪制成組織微粒的簡單步驟使胰蛋白酶與皮膚微粒結(jié)合更充分，更加有利于表皮細(xì)胞的分離。這個(gè)過程中掌握消化的時(shí)間至關(guān)重要，消化時(shí)間過長則影響表皮細(xì)胞活性，時(shí)間過短則表皮細(xì)胞不能充分游離。

最后， 表皮細(xì)胞懸液的產(chǎn)量和活力。經(jīng)過本方法消化的表皮細(xì)胞懸液中細(xì)胞的產(chǎn)量與中性蛋白酶結(jié)合胰蛋白酶法的表皮細(xì)胞產(chǎn)量比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而且兩組活細(xì)胞率比較無明顯差異。此外，本方法耗時(shí)少，方法簡單，無菌手術(shù)間即可完成操作，這提高了臨床應(yīng)用的前景。

綜上所述，切削皮法結(jié)合胰蛋白酶法制取表皮細(xì)胞懸液，制取的表皮細(xì)胞懸液的產(chǎn)量和活力與中性蛋白酶/胰蛋白酶法比較無顯著差異，但技術(shù)簡單，容易操作，耗時(shí)少，因此具有良好應(yīng)用前景。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Billingham RE，Reynolds J. Transplantation studies on sheets of pure epidermal epithelium and on epidermal cell suspensions [J].Br J Plast Surg，1952，5：25-36.

[2]Rheinwald JG，Green H.Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes：the formation of keratinizing colonies from single cells[J].Cell，1975 ，6（3）：331-343.

[3]Woodley DT，Peterson HD，Herzog SR，et al. Burn wounds resurfaced by cultured epidermal autografts show abnormal reconstitution of anchoring fibrils[J]. JAMA，1988，17：2566-2571.

[4]Wood FM，Kolybaba ML，Allen P.The use of cultured epithelial autograft in the treatment of major burn wounds：Eleven years of clinical experience [J].Burns，2006，32： 538-544.

[5]吳昌炎，房志強(qiáng)，江寶華，等.自體表皮細(xì)胞懸液在修復(fù)皮膚組織缺損創(chuàng)面中的作用研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2012，21（12）：2201-2203.

[6]張大維，樹瑜.白癜風(fēng)西醫(yī)治療的研究進(jìn)展[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2009，18（5）：730-733.

[7]李金勇，董愛麗，郭丙辰.自體表皮移植治療白癜風(fēng)供皮區(qū)兩種取皮方法的比較[J].中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2008，24（10）：798-799.

[8]Wood FM，Giles N，Stevenson A，et al. Characterisation of the cell suspension harvested from the dermal epidermal junction using a ReCell kit [J].Burns，2012， 38：44-51.

[收稿日期]2014-07-31 [修回日期]2014-08-26

編輯/何志斌