傣藥咪多領（云南琵琶甲）抑制兔耳瘢痕增生的實驗研究

趙文斌 李婭 趙川等

[摘要]目的：觀察傣藥咪多領（云南琵琶甲）提取物制劑對兔耳增生性瘢痕組織的影響。方法：建立兔耳增生性瘢痕動物模型，術后28天將模型隨機分為實驗組、陽性藥物（康瑞保）對照組和空白對照組，分別外用琵琶甲制劑、康瑞保或生理鹽水，4周后觀察各組瘢痕形態、瘢痕增生指數（HI）、成纖維細胞數量、膠原密度及轉化生長因子TGF-β1的表達。結果：實驗組、康瑞保對照組瘢痕增生指數（HI）均較空白對照組低，差異有顯著性意義（P<0.05）。實驗組、康瑞保對照組成纖維細胞數量和膠原密度與空白對照組比較均減少或降低，差異有統計學意義（P<0.05）。實驗組、康瑞保對照組轉化生長因子TGF-β1表達與空白對照組比較均減少（P<0.05）。結論：傣藥咪多領（云南琵琶甲）可抑制兔耳瘢痕增生。

[關鍵詞]琵琶甲；增生性瘢痕；動物模型

[中途分類號]R62 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2014）19-1611-04

皮膚受到創傷、炎癥刺激后，組織內有過量的成纖維細胞增殖和膠原沉積，以致失去正常皮膚的形態而形成瘢痕。目前，瘢痕的防治仍然是臨床上的難題之一。本研究利用兔耳增生性瘢痕模型觀察傣藥咪多領（云南琵琶甲）制劑對瘢痕組織的作用，為該藥防治瘢痕提供初步理論依據。

1 材料和方法

1.1實驗藥物：云南琵琶甲提取物制劑由云南省中醫醫院制劑中心提供，采用甲醇熱回流并正己烷萃取的方法制備，濃度為0.3g/ml生藥。康瑞保（復方肝素鈉尿囊素凝膠），由德國麥氏大藥廠提供。

1.2實驗動物及器材：成年健康大耳白兔12只，體重2.5～3.0kg，雌雄各半。由昆明醫科大學動物實驗中心提供并飼養，適應性喂養48h后實驗。自動石蠟包埋機（Leitz公司，德國），全自動脫水機（Sakura公司，日本），石蠟切片機（Leitz公司，德國），光學顯微鏡及照相系統（Olympus公司，日本），電熱恒溫烤箱（上海醫療設備廠）等。TGF-β1一抗、SABC試劑盒（武漢博士德公司），通用型SP檢測試劑盒、DAB試劑盒（北京中杉金橋公司）。

1.3實驗方法

1.3.1建立動物模型：先用氯胺酮20mg/kg進行兔背肌注，麻醉成功后碘伏液消毒兔耳皮膚。然后在兔雙側耳腹側分別做6個直徑為lcm、間距2cm的園形創面，完整切除全層皮膚，直至軟骨膜表面，并完整切除軟骨膜。無菌紗布壓迫止血后涂擦紅霉素眼膏，創面暴露。

1.3.2動物模型分組、給藥及處理：創面上皮化后（術后28天）將12只兔的144個創面隨機分為3組，即琵琶甲提取物制劑實驗組、陽性藥物（康瑞保）對照組和空白對照組，每組共有48個創面。實驗組、康瑞保對照組從術后28天開始給藥，分別于瘢痕局部外涂云南琵琶甲提取物、康瑞保，每次0.5ml/瘢痕，涂藥后用敷料封包，使藥物充分發揮作用，空白對照組外涂生理鹽水，3次/天。給藥4周后在同樣麻醉下切取瘢痕組織標本，切片觀察。組織學觀察：標本用體積分數10%甲醛緩釋液固定，脫水，石蠟固定包埋，切片，厚度5μm，切片后蘇木精-伊紅染色，在顯微鏡下觀察。免疫組織化學觀察：瘢痕組織石蠟包埋、切片，厚度4μm，二甲苯及梯度乙醇脫蠟至水，3%雙氧水滅活內源性過氧化物酶，檸檬酸緩沖液中高壓修復抗原，5%山羊血清封閉20min ，加入1：100倍稀釋TGF-β1一抗，4℃過夜，再滴加生物素化二抗37℃孵育20min，SABC工作液37℃處理20min，DAB溶液顯色，蘇木精復染，1%鹽酸乙醇溶液分化，飽和碳酸鋰溶液返蘭，脫水透明后封片觀察。

1.4觀察指標：①大體觀察：在給藥前（術后28天）、給藥4周后（術后56天），分別記錄兔耳瘢痕大小、顏色、質地及瘢痕厚度；②瘢痕增生指數（HI）：HE染色組織切片于低倍鏡下用測微尺測量，按公式m=A/B計算瘢痕增生指數。A=瘢痕凸起最高點至耳軟骨表面的垂直高度；B=瘢痕周邊正常皮膚皮緣至耳軟骨表面的垂直高度；③每張組織切片分別隨機選5個不重疊視野進行圖像觀察，定量檢測成纖維細胞數量和膠原密度；④轉化生長因子TGF-β1檢測：給藥4周，切取瘢痕組織，免疫組化法觀察各組標本表達情況。

1.5統計學處理：數據均以均數±標準差（x±s）表示，采用SPSS13.0統計軟件進行數據處理。對指標進行單因素方差分析和t檢驗，P<0.05有統計學差異。

2 結果

2.1瘢痕形成情況：創面傷口約7天后逐漸愈合，14～20天創面完全上皮化。給藥前（術后28天）見高出皮面的增生塊，淡紅色，觸之較軟。給藥4周后（術后56天）空白對照組增生塊較硬，充血明顯呈暗紅色，范圍不超過原創沿，厚度約為兔耳腹面皮膚厚度的3倍左右，多數瘢痕中心出現乳頭狀突起；實驗組、康瑞保對照組瘢痕稍高出皮面，淡紅色，觸之較軟，有皺褶（如圖1）。

2.2 瘢痕增生指數情況：給藥4周實驗組、康瑞保對照組和空白對照組HI分別為（2.10±0.32）、（2.01±0.29）和（3.31±0.45）。經統計學分析，治療組與康瑞保對照組之間HI差異無顯著性意義（P>0.05）；治療組、康瑞保對照組與空白對照組之間HI差異有顯著性意義（P<0.05），見表1。

2.3組織切片觀察：給藥4周時，空白對照組真皮層明顯變厚，為周邊正常真皮層厚度的3～4倍，主要是大量成纖維細胞增殖，膠原纖維增多、增粗，致密并排列紊亂，其間有少量炎性細胞，結構近似人的增生性瘢痕組織。治療組、康瑞保對照組真皮層厚度約為正常真皮層厚度的2倍，成纖維細胞數量較少，膠原纖維密度下降明顯，表層排列稍規則，成水平向，內層排列紊亂（如圖2）。治療組、康瑞保對照組成纖維細胞數量和膠原密度與空白對照組比較均減少或降低，差異明顯（P<0.05），見表2。免疫組織化學檢測結果：TGF-β1陽性信號為棕黃色顆粒，主要表達在表皮的基底層細胞和真皮附屬器的上皮細胞、血管內皮細胞和真皮深層的成纖維細胞胞漿及細胞表面。實驗組、康瑞保對照組TGF-β1呈弱陽性，空白對照組TGF-β1表達較強（如圖3）。實驗組、康瑞保對照組轉化生長因子TGF-β1表達與空白對照組比較均減少（P<0.05），實驗組與康瑞保對照組TGF-β1表達無明顯差異（P>0.05），見表3。

3 討論

皮膚創傷的愈合過程是以瘢痕形成的形式來完成的，瘢痕是創傷修復的必然產物，凡深達真皮層的傷口幾乎都以瘢痕愈合而告終[1]。瘢痕從病理學上可分為正常瘢痕和病理性瘢痕，以病理性瘢痕最多見，主要包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。病理性瘢痕是由皮膚纖維母細胞增殖及凋亡平衡失調所致的一種良性疾病[2]。瘢痕組織中基質成分主要是膠原纖維，其中又以Ⅰ型膠原纖維居多。正常情況下，傷口內的膠原合成與分解呈動態平衡，在某些情況下，這種平衡被打破，導致成纖維、肌纖維母細胞合成膠原增多，而膠原纖維分解減少，膠原合成速度遠大于膠原分解，最終導致了膠原沉積形成瘢痕組織。目前研究證實發生機制可能是由微循環、免疫、基因表達、細胞增殖和凋亡、膠原代謝和排列、細胞因子等多種因素共同作用的結果[3-4]。近年來，TGF-β被認為與創傷愈合、瘢痕形成及多種纖維化性疾病關系最具代表性的細胞因子之一[5-6]。

目前，瘢痕的治療方法主要有手術切除、類固醇激素、抗代謝藥、免疫抑制劑、放射療法和硅膠膜等[7]，外科手術的局部復發率高達80%[8]，在外科術后輔以加壓、激光治療等方法可降低局部復發率，但其復發率仍在50%以上[9]。放射治療是目前外科手術后降低瘢痕復發的有效方法，但其復發率大約在20%左右[10]。上述方法因易復發或嚴重的全身性副作用而限制了臨床應用，因此從祖國中醫中藥及民族藥中篩選出療效確切、副作用小的防治瘢痕的有效藥物，具有重要的臨床意義。

祖國醫學對瘢痕的治療有著悠久的歷史，有關瘢痕的病機認識，一般認為本病與先天稟賦，素體特異有關，加之遭受金創，水火之傷，余毒未盡，氣滯血瘀，搏結經絡而成[11]。治療上多采用活血化瘀、攻毒散結、通絡止痛、酸澀收斂之品。喙尾琵琶甲（云南琵琶甲）是云南民間長期使用的一種藥用昆蟲，具有抗菌、消炎、解毒、調節機體免疫功能、提高抗病能力的作用，《西雙版納傣藥志》、《中華本草》傣藥卷記載，該蟲傣藥名“咪多領”，功效為清熱解毒、軟堅散結、消腫止痛、熄風定驚，可內服亦可外用。筆者在臨床試用該蟲制劑治療增生性瘢痕收到較好的療效，用藥后瘢痕明顯萎縮變軟，痛癢癥狀消失或明顯減輕，證明其“清火解毒、軟堅散結、消腫止痛”的功效。

本研究采用兔耳增生性瘢痕的動物模型實驗觀察云南琵琶甲制劑對兔耳增生性瘢痕的作用，觀察其對瘢痕組織形態學的影響。我們參照文獻[12-13]制作了兔耳增生性瘢痕模型，結果顯示大體形態學變化、組織學變化以及成纖維細胞密度與瘢痕增生指數變化符合文獻報道，表明動物模型復制成功。本實驗結果表明云南琵琶甲制劑對兔耳瘢痕組織增生有明顯的抑制作用，表現為與對照組相比實驗組真皮層厚度、瘢痕增生指數較小，成纖維細胞數目明顯減少，膠原纖維致密下降，排列較規則，轉化生長因子TGF-β1表達明顯減少。云南琵琶甲制劑防治瘢痕具有安全、有效、價格低廉的優點，將有廣闊的前景，其具體有效成分及作用機制有待進一步深入研究。

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[收稿日期]2014-07-25 [修回日期]2014-08-31

編輯/何志斌