延胡索氯仿提取物對玉米、大豆幾種病原真菌的抑菌活性研究

摘 要：為了對三江平原玉米、大豆常發生病害進行更好的治理與防治，通過采用菌絲生長速率法和載玻片法，研究了延胡索氯仿提取液對玉米、大豆幾種常見真菌病害的離體抑菌活性。菌絲生長速率法試驗結果表明：延胡索氯仿提取液對玉米紋枯病和大豆灰斑病的抑制率最高，均在80%以上，EC50值52.98～58.98 mg/L；孢子萌發法試驗結果表明：對所供試的病原真菌孢子萌發抑制率均很高，其中對玉米小斑病和大豆灰斑病的孢子萌發抑制率達到了100%；活體生物防治試驗結果表明：除對玉米紋枯病的防治效果達到了61.46%外，對其他病害防治效果均在60%以下。

關鍵詞：延胡索；菌絲生長速率；孢子萌發；生物防治

中圖分類號：S432 文獻標志碼：A 論文編號：2013-0597

0 引言

化學農藥的使用在防治作物病蟲害，保證作物穩產和高產方面發揮了重要作用[1]，但長期依賴和大量使用有機合成化學農藥，已經帶來了眾所周知的環境污染、生態平衡破壞和食品安全等一系列問題，對推動農業經濟實現持續發展帶來許多不利的影響。因此，開發生物活性高、對非靶標生物安全、與環境可容性強的生物農藥已成為農藥未來發展的新趨勢。

延胡索為罌粟科紫堇屬植物。具有活血化瘀、理氣止痛功效，其主要活性成分為生物堿，其中以延胡索甲、乙、丑素等為主[2]。活性成分的常用提取方法有滲漉法[3]、醇回流法[4]和超聲提取法[5]。延胡索的鎮痛、鎮靜催眠、抗冠心病等作用已得到廣泛研究與臨床應用。但對抑菌方面的活性少見報道，胡定慧等[6]得出延胡索不同提取物對金色葡萄球菌具有很高抑制作用，桑曉媛等[7]利用延胡索生物堿提取物對肝癌細胞的體外細胞毒活性測定，結果表明對SMMC27721的生長抑制活性最高，IC50約為35 μg/mL。前人對延胡索提取物的研究均是臨床上的應用研究為主，對植物病害的研究尚屬空白。為此，筆者以延胡索提取物為藥劑，用傳統的體外抑菌活性試驗方法，初步研究延胡索提取物對玉米、大豆幾種常發真菌病害進行抑菌研究，為進一步開發延胡索在植物農藥方面的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

延胡索（購于佳木斯醫藥店）；純品多菌靈（50%可濕性粉劑）北京聯興化工有限公司。

1.2 供試菌種

供試菌種有玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）、玉米大斑病菌（Exserohilum turci-cum）、玉米紋枯病菌（Rhizoctonia solani Kuhn）、大豆灰斑病菌[cercosporidium sofinum （Hara） Liu & Guo]、大豆菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary）以上菌種由沈陽農業大學植物保護學院提供。

1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1000 mL。

1.4 試驗方法

1.4.1 延胡索氯仿提取液的制備 準確稱取延胡索粉末10 g，蒸餾水浸泡1天，離心棄沉淀，得粗提液，減壓濃縮至50 mL，該溶液氯仿萃取，充分振蕩，靜置，直到兩相液面完全分開。用分液漏斗將有機溶劑相與水相分開，收集有機溶劑，減壓濃縮后無菌水溶解，配制成125 mg/L、250 mg/L、500 mg/L、1000 mg/L的待測藥液。

1.4.2 菌絲生長速率試驗 在無菌操作條件下，取一定量的植物提取物與已溶化并冷卻至45～50℃的培養基充分混合后，倒入直徑為9 cm的培養皿中制成含藥培養基，用無菌打孔器在事先培養好的植物病原真菌的菌絲平展處打直徑6 mm小菌餅，接到上述平板中央，每皿1片，每處理重復3次，以無菌水作空白對照。3天后用十字交叉測量法測量菌落直徑，并計算菌絲生長抑制率[8-9]。

1.4.3 孢子萌發試驗法 將平皿內培養一定時間的病原菌孢子用滅菌水配成每10×視野中100～120個的孢子懸浮液，將稀釋好的孢子懸浮液移至6孔凹板板孔中，蓋上蓋放入恒溫培養箱中培養24 h或48 h后調查并計算孢子萌發率[9-10]。

1.4.4 活體試驗 用藥前一天選擇生長勢一致的3葉期盆栽幼苗，按處理分組編號待用。先用棉團沾上酒精將其葉片擦凈，干后用細霧噴霧器將不同處理的藥劑均勻地噴在葉片正背面上，待藥劑充分晾干后用細霧噴霧器在幼苗上均勻噴霧接種孢子懸浮液。接種后立即移至恒溫室（26～28℃）中，并放置加濕器（RH 100%），12 h黑暗、12 h光照交替使用，從而誘發病害，并每天觀察玉米苗生長有無異常，當空白對照病斑穩定后即可根據病斑多少進行分級調查[10-11]。

病情指數={[∑（各級發病數×該級代表值）]/（考察總苗數×最高級代表值）}×100%…（1）

防治效果=[（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數]×100%…（2）

1.5 數據分析

統計分析采用DPS 7.05及Excel。

2 結果與分析

2.1 延胡索氯仿提取液對供試真菌菌絲生長速率抑制效果研究

從圖1中可以看出，延胡索氯仿提取液對玉米紋枯和大豆灰斑2種病原真菌菌絲生長的抑制效果最好，在濃度為1000 mg/L時分別達到了81.79%和85.36%，對大豆菌核病菌的抑制效果最差，為65.18%，對其他2種病菌的抑制率在70%以上，當濃度降到125 mg/L時，延胡索氯仿提取液對玉米紋枯和大豆灰斑的抑制率也在70%左右，而對其他3種病菌的抑制率則降到了60%以下。

根據上述對菌絲生長抑制率的結果，應用DPS程序進行毒力回歸分析并計算出毒力回歸方程，求出抑制中濃度的濃度劑量，結果見表1。從表1中可以看出，延胡索氯仿提取液對大豆灰斑病菌和玉米紋枯病菌的EC50值均低于60 mg/L，說明抑菌活性很高；其次是對玉米大斑病菌和玉米小斑病菌的EC50值在150 mg/L以下；對大豆菌核病菌的抑制效果最差。

2.2 延胡索氯仿提取液對供試真菌孢子萌發抑制效果研究

由表2可以看出，在濃度為1000 mg/L和500 mg/L時，延胡索氯仿提取液對玉米小斑病菌和大豆灰斑病菌的孢子萌發率均達到了100%，高于對玉米大斑病菌的抑制率，在濃度為250 mg/L時，對3種病原真菌的孢子萌發抑制率均超過了70%，說明延胡索氯仿提取液對3種病原真菌的孢子萌發均具有較高的抑制率，對玉米小斑病菌和大豆灰斑病菌在濃度為1000 mg/L與500 mg/L時抑制率無顯著差異。

2.3 延胡索氯仿提取液對供試作物真菌病害活體防治效果研究

從表3中可以看出，延胡索氯仿提取液對玉米紋枯病的防治效果達到了61.46%，對玉米大斑病和大豆菌核病的防治效果均在50%以上，均與標準藥劑相比差別仍較大，對大豆灰斑病和玉米小斑病的防治效果較差。

3 結論與討論

化學藥劑防治玉米、大豆等作物上常發病害是控制其發生、減少損失的最有效途徑之一。而長期使用化學合成殺菌劑會使病菌對藥劑產生不同程度的抗藥性。所以有必要尋找開發低毒、安全的新型生物藥劑。

本試驗采用菌絲生長速率法測定延胡索氯仿提取液對供試真菌的抑菌作用，結果顯示，延胡索氯仿提取液對玉米紋枯病菌和大豆灰板病菌菌絲生長抑制率最高，孢子萌發試驗表明對玉米小斑病菌和大豆灰板病菌的抑制效果最好，達到了100%，活體生物防治試驗結果發現對玉米紋枯病的防治效果最高，達到了61.46%，對其他供試病菌防治效果較差。室內藥效測定與田間試驗相比省工省時，但是室內藥效測定結果與田間防治效果有一定差別，在實際生產中一旦藥劑施入田間，會受到天氣變化，以及動植物及人為原因等其他外界條件的影響。這些特點在室內藥劑試驗中無法體現，所以不能只憑借室內試驗完全斷定其生物活性大小。在抑菌活性物質篩選[11-12]中應采用多種方法有機結合，藥劑使用得靠多次田間藥效試驗結果來證明。

延胡索是一種具有很好開發價值的有毒植物抑菌劑資源，從中提取分離出的活性物質對某些病菌具有很高的抑菌活性，目前對延胡索已經開發出的生物堿類對動物體及人體腫瘤、大腸桿菌具有很高的抑菌作用，已有報道[13-15]。本研究結果表明延胡索氯仿提取液通過不同試驗方法對所供試的病原真菌具有較高抑菌活性，但對其作用機理以及田間試驗等還有待于進一步研究。

參考文獻

[1] 趙磊，杜娟，卜春亞，等.瑞香狼毒活性物質對草莓灰霉病菌的抑制作用[J].植物病理學報，2012，42（4）：411-417.

[2] 黃康泰.常用中藥成分與藥理手冊[M].北京：中國醫藥科技出版社，1994：874.

[3] 桑彤，謝培德.延胡索滲漉提取工藝的優選[J].基層中藥雜志，2000，14（3）：35-36.

[4] 孫百虎，尚平，卜欣立.元胡中生物堿的醇回流提取[J].河北化工， 2008，31（2）：41-44.

[5] 秦秀蓉，湯燕.超聲法提取延胡索有效部分的工藝研究[J].成都中醫藥大學學報， 2005，28（4）：47-52.

[6] 胡定慧，丁建剛，張敏，等.延胡索提取物抑菌活性的初步研究[J].遼寧中醫雜志，2007，34（4）：496-497.

[7] 桑曉媛，張磊，劉立，等.延胡索生物堿的提取及其抗肝腫瘤活性研究[J].浙江理工大學學報，2009，26（5）：754-756.

[8] 吳文君.植物化學保護試驗技術導論[M].西安：陜西科學技術出版社，1988.

[9] 方中達.植病研究方法（第3版）[M].北京：中國農業出版社，1998.

[10] 慕立義.植物化學保護研究方法[M].北京：中國農業出版社，1991.

[11] 申曉慧，李翔國，劉海峰.延胡索、白頭翁提取液的離體抑菌作用測定[J].延邊大學農學學報，2006，28（1）：35-40.

[12] 申曉慧，姜成，張敬濤.兩種有毒植物提取物的抑菌活性研究[J].作物雜志，2009（4）：35-37.

[13] 倪長春，沈宙，顧必文，等.殺菌劑生物活性篩選離體活體兼顧的重要性[J].浙江化工，2000（S1）：61-64.

[14] 張穗.殺菌劑生物測定技術[J].植物保護，1999，25（3）：35-37.

[15] 賀凱，高建莉，趙光樹，等.延胡索化學成分、藥理作用及質量控制研究進展[J].中草藥，2007，38（12）：1909-1912.